牛β-防御素BNBD11在大肠杆菌中的表达及抑菌活性测定

【摘要】：牛中性粒细胞β-防御素(bovine neutrophilβ-defensins,BNBDs),共13种,即BNBD1-13,其中天然的BNBD11具有抗大肠杆菌和金黄色葡萄球菌活性。本研究通过基因工程方法,在大肠杆菌中高效表达了经过密码子修饰的抗菌肽基因BNBD11,并对表达产物进行分离、纯化以及抑菌活性测定。具体包括以下三部分: 1. BNBD11基因的优化合成及表达载体的构建。根据天然抗菌肽BNBD11的氨基酸序列,参照大肠杆菌的偏爱密码子,设计BNBD11的基因,并添加甲酸切割位点,采用人工合成的方法得到优化的抗菌肽基因。然后将目的片段用KpnⅠ和HindⅢ这2个酶切位点定向连接在原核表达载体pET32a上,转化到E. coli DH5α,PCR结果表明在135 bp处出现预期条带,测序结果与设计序列完全一致,证明表达载体pET32a-BNBD11构建成功。 2.融合蛋白在大肠杆菌中的表达及其纯化。重组表达载体pET32a-BNBD11在E. coli BL21(DE3)中成功表达出21 ku的融合蛋白Trx-BNBD11。经过表达条件优化,融合蛋白主要以可溶性形式高效表达。采用Ni Sepharose柱亲和层析法纯化融合蛋白。融合蛋白透析除盐后用50%甲酸进行切割,50℃反应24 h可使融合蛋白基本被切割。 3. BNBD11的纯化及抑菌活性测定。Trx-BNBD11经甲酸切割后的混合物再用RP-HPLC纯化,微量稀释法筛选有抑菌活性的组分,Tricine-SDS-PAGE鉴定结果表明获得了高纯度的重组BNBD11。采用微量稀释法对纯化后的样品进行了最小抑菌浓度(MIC)测定,结果表明重组BNBD11对大肠杆菌ATCC25922有较强抑菌效果,其MIC为20μg/mL,但对金黄色葡萄球菌ATCC2592的抑菌效果不明显。 本研究构建了遗传密码优化的BNBD11基因表达的工程菌,并获得高纯度的重组BNBD11,并对重组BNBD11进行了抑菌活性测定,为进一步研究BNBD11奠定了基础。