利用微生物发酵提取杜仲胶的研究

【摘要】：采集杜仲老林区的土壤和腐殖质,以杜仲皮作为基质多次富集培养,分离其优势菌株,测定其对杜仲皮的发酵性能指标,建立菌株综合选择指数以评价菌株的优劣,筛选鉴定生物法提取杜仲胶的优良菌株,并对其发酵条件和发酵培养基进行优化,同时探讨菌株发酵过程中纤维素酶解的作用机理。本研究旨在为生物法提取杜仲胶提供优良菌株并为此方法的应用提供理论依据。主要研究结果如下: (1)试验分离得到能以杜仲皮为基质生长良好的真菌27株,细菌18株。筛选得到能用于杜仲胶提取的优良菌株有真菌P-24,MT-6,MT-4,P-22;细菌X-8,X-47,X-32。其中,真菌对杜仲皮的4个发酵性能指标(发酵降解率、发酵物去除率、剩余物中的杜仲胶含量及杜仲胶得率)均普遍高于细菌。菌株P-24和MT-6在验证性试验中发酵性能稳定,可以作为备用优良菌株。从形态学特征及分子生物学两方面对菌株P-24和MT-6进行鉴定。确定菌株P-24为青霉菌属草酸青霉(Penicillium oxalicum),菌株MT-6为曲霉属黑曲霉(Aspergillus niger)。 (2)筛选出的草酸青霉P-24具有发酵周期短,降解能力强,得胶率高的优点,具有实际应用的潜力,其对杜仲皮发酵12d后,发酵物去除率达92.23%,可以进一步推广应用。 (3)发酵时间,基质含水率,初始PH以及发酵温度均会对杜仲皮的降解效果产生显著的影响。通过单因素试验,确定菌株P-24最佳发酵条件为:温度(30±1)℃,基质含水率67.7 %,初始PH7.0,以玉米粉和硝酸铵作为起爆剂发酵时间12d。通过三元二次回归设计建立杜仲皮发酵物去除率的数学模型,优化发酵培养基配方,确定其最佳配比条件为:玉米粉0.50 %,硝酸铵1.00%,基质含水率67.80 %。在此配方下发酵,杜仲皮发酵去除率为94.22%,此时CMC酶活力为2.9788μmol/(min?g),果胶酶活力为5.1145μmol/(min?g)。 (4)菌株综合选择指数在杜仲皮发酵提取杜仲胶优良菌株筛选中的应用是可行的。采用菌株综合选择指数评价菌株的优劣,一方面可以避免单一指标筛选菌株时对某些优良菌株的漏筛;另一方面可以更全面的反映菌株的发酵性能。采用菌株综合选择指数进行杜仲胶生物提取菌株的筛选具有简单易行,实用性强的特点。 (5)杜仲皮纤维素类降解机理的研究表明:微生物发酵杜仲皮时产生的CMC酶及果胶酶直接影响其对纤维类物质的降解能力。CMC酶和果胶酶活力的大小与发酵物去除率成强相关关系。菌株P-24单因素试验中,CMC酶和果胶酶活力的变化表明,发酵时间,发酵温度,初始pH以及基质含水率都是通过影响菌株自身的生长繁殖,促进或者阻碍菌株产CMC酶及果胶酶活力的能力及影响产酶量的增加,进而直接影响纤维素酶解反应的速度。碳源作为一种诱导物,可诱导菌株P-24产生纤维素酶;氮源的添加可以补充菌株生长所需的营养物质,进而提高CMC酶和果胶酶活力。