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百合转蓝色基因品种的选择及其遗传转化研究

张萍  
【摘要】:近年来,转基因蓝色康乃馨和蓝色玫瑰的成功投入市场引起了人们对蓝色花基因工程的普遍关注,并引起诸多学者对其进行广泛而深入的研究。同玫瑰和康乃馨一样,百合中由于缺少类黄酮3’5’羟化酶(flavonoid 3',5'-hydoxylase, F3'5'H)-飞燕草色素生物合成途径的关键酶,故在自然界中缺少蓝色百合品种。 大量研究证实除主要控制蓝色形成的相关基因外,花瓣液泡pH值、花瓣内的花色素苷和辅色素(主要是黄酮醇)等对形成蓝色花的效应亦不可忽视。本实验在此研究基础上首先通过外部观察选择10个花色为粉红至紫红的百合品种,并对其进行花瓣液泡pH值、花色素苷及黄酮醇测定,利用灰色关联分析理论确定适宜转蓝色基因的受体品种;其次通过薄细胞层(thin cell layer, TCL)培养技术建立了一个高效的OT百合‘罗宾娜’遗传转化受体系统;最终通过农杆菌介导法将蓝色形成相关基因(如蝴蝶兰F3'5'H基因与矮牵牛DifF基因或蝴蝶兰F3'5'H基因与风信子DFR基因)导入选定百合中,以期获得蓝色百合。本研究获得的主要结果: 1.确定花瓣中矢车菊色素含量少、黄酮醇含量高、液泡pH值高的OT杂种百合‘罗宾娜’(Lilium tenuifolium oriental x tumpet‘Robina’)和东方百合‘贝尼尼’(Lilium tenuifolium oriental‘Bernini’)为适宜转蓝色基因的受体品种。 2.通过TCL培养技术建立‘罗宾娜’百合的遗传转化受体系统 (1)植物生长调节物质NAA与TDZ、2,4-D与6-BA均不能诱导OT百合‘罗宾娜’鳞片横向薄细胞层(transverse thin cell layers, tTCLs)产生体细胞胚; (2)诱导田间种球鳞片tTCLs产生小鳞茎的适宜培养基为MS+1.0 mg l~(-1) NAA+0.1 mg l~(-1) TDZ+30 g l~(-1)蔗糖+8 g l~(-1)琼脂; (3)诱导试管苗鳞片tTCLs再生幼苗的适宜培养基为MS+0.3 mg l~(-1)6-BA+0.8 mg l~(-1) 2,4-D+30g l~(-1)蔗糖+8 mg l~(-1)琼脂; (4)液体MS培养基预处理的培养方法能显著促进植株再生,标准浓度激素液体MS预培养18h时幼苗再生率为68.61%(对照为30.83%),高浓度2,4-D液体MS预培养6h时幼苗再生率为80.82%(对照为49.52%); (5)再生幼苗在生根培养基(1/2MS +0.5 mg l~(-1) IBA+0.1% AC+30 g l~(-1)蔗糖+8 g l~(-1)琼脂)中的生根率为100%,平均每个外植体上形成的根数为3.17个,生根的完整植株的移栽成活率为74.29%。 3.农杆菌介导的百合遗传转化 (1)田间种球鳞片tTCLs不能作为遗传转化受体,试管苗鳞片tTCLs为适宜转化受体; (2)试管苗鳞片tTCLs的潮霉素筛选浓度为20 mg l~(-1); (3)使用两种不同的植物表达载体进行遗传转化:获得含蝴蝶兰F3’5’H基因与矮牵牛DifF基因的潮霉素抗性苗40个,含蝴蝶兰F3’5’H基因与风信子DFR基因的潮霉素抗性苗60个。


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