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小麦多子房性状SSH文库的构建及其相关基因的克隆与表达

栗现芳  
【摘要】:多子房小麦具有明显的穗粒数优势,如能应用到杂交小麦育种中将会是提高繁制种系数的一种有效途径,进而对杂交小麦的发展将会起到一个极大地促进作用。目前有关多子房小麦的研究多集中在花器官的发育过程、种子萌发过程中的生化研究、分子标记、基因定位和遗传分析,对小麦多子房性状形成的分子机制研究至今仍是空白。小麦多子房品系Ⅱ(简称多Ⅱ)近等基因系(near-isogenic line, NIL)是由西北农林科技大学专为研究多子房性状的分子遗传机理而创制的一种试验材料,其多子房、单子房性状遗传稳定,其它遗传背景和农艺性状与轮回亲本一致,是研究多子房性状分子机制的良好试材。为了深入揭示小麦多子房性状形成的分子机制,本研究利用上述材料,首次以SSH(Suppression Subtractive Hybridization, SSH)技术分别构建了多子房和单子房相关基因特异表达的抑制消减杂交cDNA文库,通过对两个cDNA文库的克隆测序、EST序列比对分析和功能分类,探讨了小麦多子房和单子房性状各自表达基因的种类和功能的异同,并从中选择了部分基因进行了表达分析和cDNA、DNA序列的克隆,获得如下重要结果: 1.对小麦多ⅡNIL的外显率、多粒结实率、发芽率进行了调查与分析,同时在田间调查过程中发现了每朵小花具有4~6个雌蕊的新变异类型。不同株系间多子房性状外显率分布在77.2~95.3%之间,平均为88.6%;多粒种子平均结实率为79.9%;多子房株系主位种子与单子房株系种子发芽率基本一致,副位种子发芽率稍低;分析推测小麦多子房新突变现象是在原本遗传稳定的多子房性状基础上进一步发生了雄蕊心皮化的结果,第4~6个雌蕊未能成功受精结实。 2.以小麦多ⅡNIL的多子房和单子房株系幼穗cDNA互为Tester和Driver,利用SSH技术成功构建了小麦多子房和单子房性状相关基因的cDNA文库(简称为Mu文库和Mo文库)。Mu文库共得到约2536个菌落,其中白斑2383个,重组率为93.97%;Mo文库共得到约4543个菌落,其中白斑4359个,重组率为95.95%。分别采用巢式引物和通用引物对随机挑取的克隆进行PCR检测,两个文库85%以上的克隆皆能扩增出目的片段,基本介于200~750bp之间,多数集中在400~500 bp之间。对部分阳性克隆提取质粒及酶切,插入片段大小主要集中在450bp左右,与菌液PCR检测结果一致。 3.从Mu和Mo文库中,各随机选择100个阳性克隆进行测序。Mu文库中所获EST片段平均大小为378bp。去除低质量序列及重复序列后,共获得90条EST,其中65条功能已知,占全部EST的72.22%。参与蛋白合成的最多,占27.69%;其次为亚细胞定位相关的基因,占10.77%;与能量、转录相关的基因各为7.69%;与新陈代谢、生长发育、结合功能蛋白相关的基因各为6.15%;占比例较低的是与蛋白加工、细胞通信与信号转导、细胞防御等相关的基因。Mo文库中所获EST片段平均大小为339bp。去除重复序列后,共获得89条EST,其中60条功能已知,占全部EST的67.42%。在已知功能序列中,未分类功能蛋白的序列较多,占33.33%;与新陈代谢有关的基因占11.67%;亚细胞定位相关基因占10%;与能量、蛋白合成、蛋白加工、结合功能蛋白相关的基因各占6.67%。不同功能的蛋白在两个库中所占比例不一致,Mu文库以蛋白合成、转录和生长发育相关蛋白为主;而Mo文库以物质代谢、蛋白加工及细胞运输途径相关蛋白为主。 4.利用半定量RT-PCR对两个文库中的12个相关基因进行了时空表达研究。Mu文库中所选的6个基因在多子房株系都有不同程度的上调表达,40S核糖体蛋白S6、核内小核糖核蛋白质G、核糖体蛋白L10A差异较为明显,其次为核糖体蛋白s15a、14-3-3蛋白、60s核糖体蛋白L21,而假定的脯氨酰4 -羟化酶、伴侣蛋白、CER1蜡质合成酶基因差异不明显;Mo文库中尿苷二磷酸葡糖醛酸脱羧酶、60S核糖体蛋白L17-1在单子房株系中上调表达,半胱氨酸蛋白酶抑制剂差异较小;多数基因1~12mm幼穗时期内表达量呈上升趋势,广泛存在于各种组织,在茎顶端表达量高于其他组织。研究推测,差异表达的基因可能参与了多子房性状的发生。 5.以SSH文库中筛选出的小麦RPS15a和RPL21基因序列为信息探针,通过同源序列搜索、聚类拼接、RT-PCR和PCR克隆,获得了RPS15a、RPL21基因的cDNA和DNA序列。小麦RPS15a基因的cDNA序列(GenBank登录号:HM055513)长为413 bp,编码130个氨基酸;DNA序列(GenBank登录号:HM063421)长为642 bp,含有3个外显子和2个内含子。小麦RPL21基因cDNA序列(GenBank登录号:HM138480)长521bp,编码164个氨基酸,氨基酸序列在植物与动物间相似性较差;DNA序列(GenBank登录号:HM138481)长1600bp,含有2个外显子和1个内含子。在不同材料中,这两个核糖体蛋白基因在多子房株系2~4mm幼穗中表现不同程度的表达上调,可能与小麦多子房性状的发生有关,其具体功能作用尚需进一步验证。 6.以SSH文库中筛选出的小麦Cab基因序列为信息探针,通过同源序列搜索、聚类拼接和RT-PCR,获得了小麦Cab基因的cDNA序列(GenBank登录号:HM362991)。序列长862bp,编码266个氨基酸,与之前EST序列拼接延伸后得到924bp的序列。在不同材料中,Cab基因在单子房株系2~3和3~4mm中表达量下调;在单子房株系1~6mm幼穗时期内,2~3mm幼穗中表达量较低;不同组织中差异明显,幼叶中表达量最高,幼根中无表达。


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