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转录辅激活子MED1在小鼠脂肪肝形成中的调控作用

白亮  
【摘要】:非酒精性脂肪肝疾病是一种无过量饮酒史,以肝细胞脂肪变性和脂肪贮积为特征的临床病理综合征。肝脏脂肪代谢长期紊乱,最终会发展为非酒精性肝炎、肝硬化和肝癌。严重影响人类健康。因而,探索调控肝脏脂肪代谢和系统能量平衡的作用机制成为全球科研工作者面临的挑战和关注热点。近年来,研究表明,肝脏脂肪代谢主要受PPARs核受体超家族的调控。PPARα和PPARβ/δ主要参与脂肪酸氧化代谢。而PPARγ主要参与脂肪细胞分化和成熟脂肪细胞脂肪的贮存,掌控着脂肪肝的形成和肝脏脂肪代谢。PPARγ调控的生脂靶基因的转录需要一些辅激活子和辅激活子相关蛋白,如MED1、SRC/p160蛋白家族、PRIP、PIMT、和PRIC285等。研究发现,MED1是Mediator复合物的一个关键成员,在RNA聚合酶II依赖型转录调控中发挥重要作用。周身敲除MED1导致小鼠在胚胎期11.5 d死亡。MED1对PPARα调控的转录活性以及PPARα配体诱导的肝脏肿瘤的形成是必不可少的。而且,MED1在PPARγ诱导的小鼠胚胎成纤维细胞向脂肪细胞分化过程中具有关键作用。然而,目前有关MED1及其他辅激活子在PPARγ功能发挥中的调控作用尚不清楚。 本研究中,我们以周身基因敲除鼠和肝脏特异性敲除鼠为实验动物模型,运用腺病毒扩繁及纯化技术、HE染色、油红O染色、免疫组织化学染色、免疫荧光染色、激光共聚焦技术、甘油三酯和胆固醇酶试剂盒检测、快速蛋白液相色谱分析、原代肝细胞分离和培养、Real-time PCR、Northern Blot、Western Blot、ChIP分析和基因芯片等生物化学、细胞及分子生物学技术,深入探索了转录辅激活子MED1在高脂日粮和PPARγ诱导脂肪肝形成中的调控作用。获得的主要研究结果: 1.在体实验表明,MED1是PPARγ介导脂肪肝形成的必需辅激活子。MED1~(ΔLiv)和MED1~(fl/fl)鼠经尾静脉注射Ad/PPARγ6 d,MED1~(fl/fl)鼠在PPARγ诱导下呈现出严重的脂肪肝,而MED1~(ΔLiv)鼠却能够抵抗PPARγ刺激的脂肪肝生成。基因表达谱分析和Northern Blot检测表明,高表达PPARγ的MED1~(ΔLiv)鼠肝脏不能有效表达生脂标志基因aP2、adipsin和adiponectin以及脂滴相关蛋白caveolin-1、CideA和S3-12等,而这些基因在PPARγ高表达的MED1~(fl/fl)鼠脂肪肝中强烈表达。基因芯片分析结果发现,肝脏MED1特异性敲除,PPARγ调控的生脂信号通路,如脂肪生成、贮存、运输和氧化等通路处于失活状态,提示PPARγ信号通路的激活需要完整的MED1。而且,外源表达MED1能够挽救Ad/PPARγ刺激的脂肪肝形成及脂肪相关基因诱导表达。ChIP分析表明,高表达PPARγ的肝脏MED1敲除鼠aP2启动子区无MED1募集,PPARγ的募集显著减少,转录辅激活子PRIP和PIMT的募集能力略微减弱。 2.离体实验表明,MED1是PPARγ诱导肝细胞发生脂肪变的必需辅激活子。从MED1~(ΔLiv)和MED1~(fl/fl)鼠分离获得的原代肝细胞感染Ad/PPARγ12 h,油红O染色检测发现,MED1阳性肝细胞能够向脂肪细胞转化,而MED1缺失的肝细胞却不能发生脂肪变。Q-PCR检测结果表明,MED1缺失的肝细胞能够抵抗PPARγ诱导的脂肪标志基因aP2以及PPARγ靶基因S3-12和CideA的表达。 3.其他转录辅激活子SRC-1、PRIC285、PRIP和PIMT对PPARγ刺激的脂肪肝形成无影响。SRC-1周身敲除(SRC-1~(-/-))、PRIC285周身敲除(PRIC285~(-/-))、肝脏PRIP特异性敲除(PRIP~(ΔLiv))和肝脏PIMT特异性敲除(PIMT~(ΔLiv))鼠及其相应的对照鼠经尾静脉注射Ad/PPARγ5 d后,组织学和Northern Blot检测结果发现,SRC-1~(-/-)、PRIC285~(-/-)、PRIP~(ΔLiv)和PIMT~(ΔLiv)鼠及其相应的对照鼠都形成严重的脂肪肝,并强烈表达脂肪生成标志基因和PPARγ靶基因。因而,转录辅激活子MED1在PPARγ诱导的脂肪肝形成中是必需的。 4. MED1是高脂日粮诱导脂肪肝形成的必需调控子。MED1~(ΔLiv)和MED1~(fl/fl)鼠饲喂高脂日粮(60% kCal脂肪) 0、1、2、4、8和16 w,组织学检测发现,MED1~(ΔLiv)鼠能够抵抗高脂日粮诱导的脂肪肝形成,而MED1~(fl/fl)鼠肝细胞中有大量脂滴积聚,呈明显的脂肪肝状,但并不表达PPARγ的靶基因aP2,提示MED1通过PPARγ非依赖性通路调控肝脏脂肪生成。而且,短期高脂日粮饲喂,MED1~(ΔLiv)鼠血浆胆固醇含量显著上升。此外,GTT和ITT分析揭示,肝脏MED1特异性敲除鼠葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性增加。 5.禁食状态下肝脏MED1特异性敲除鼠呈现高脂血症。长期禁食(72 h),MED1~(ΔLiv)鼠不发生肝脏脂肪变性。禁食24、48和72 h,与MED1~(fl/fl)鼠相比,MED1~(ΔLiv)鼠血浆甘油三酯和胆固醇水平显著升高,呈高脂血症。FPLC检测结果表明,正常饲喂条件下,MED1~(ΔLiv)鼠和MED1~(fl/fl)鼠血浆脂蛋白峰相似,而禁食24 h,MED1~(ΔLiv)鼠血浆携带甘油三酯和胆固醇的VLDL峰严重积聚,提示MED1可能调控VLDL。 本文运用肝脏MED1特异性敲除鼠模型,体内和体外研究证实,转录辅激活子MED1在脂肪肝形成过程中发挥关键作用。MED1肝脏特异性敲除鼠能够抵抗高脂日粮和PPARγ诱导的脂肪肝形成和生脂基因表达。而其他转录辅激活子SRC-1、PRIC285、PRIP和PIMT敲除缺对PPARγ调控的肝脏脂肪变性无影响。因而,MED1是脂肪肝形成的正调控基因,是PPARγ功能发挥的必需辅激活子。本研究为理解脂肪肝调控的复杂性开辟了一个崭新的局面,为脂肪肝的预防和治疗提供了新的研究思路和靶点。


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