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利用重组腺病毒介导人端粒酶催化亚基(hTERT)制备牛乳腺细胞体外模型的研究

贺小英  
【摘要】:乳腺上皮细胞是制作乳腺生物反应器并且评估乳腺特异性表达载体功能的靶细胞。由于乳腺细胞体外培养较为困难,到目前为止,能够用于乳腺特异表达载体功能检测的细胞系并不多见。此外,大量研究表明许多细胞系存在细胞异质性、基因变异等异常现象,因此,乳腺细胞系似乎更适合作为癌症模型的研究。而建立安全有效的乳腺细胞体外研究模型是解决乳腺生物反应器制备转基因动物的关键。因此,本研究首先优化了牛乳腺细胞体外培养条件,在此基础上,利用腺病毒介导人端粒酶催化亚基(hTERT)感染牛乳腺上皮细胞(bMGEs),获得阳性细胞株hTERT-bMGEs,并进一步对其进行细胞生物学特性及功能鉴定,获得如下主要结果: 1.利用二次组织贴壁法纯化细胞效果较好(即贴壁的乳腺组织通过显微镜观察,将有直接迁出bMGEs的组织重新分离贴壁),此法获得的细胞纯化彻底,形态良好,生物学特征稳定,细胞增殖迅速。 2.通过比较不同的生长因子对bMGEs体外增殖的影响,结果发现DMEM/F12基础培养液+10%胎牛血清+2 mM谷氨酰胺+10 ng/mL表皮生长因子+10μL/mL ITS +5μg/mL胰岛素+5μg/ mL氢化可的松是bMGECs体外培养最适液。 3.构建了融合表达载体pEGFP-hTERT并检测体外培养bMGEs的转染效率,结果表明利用二次组织贴壁法获得的原代bMGEs能显著提高转基因的效率,最高转基因效率能够达到33%以上。 4.构建了含hTERT基因的重组腺病毒载体Ad-hTERT,并包装重组病毒rAd-hTERT,初始病毒滴度为3×10~7 pfu/mL,扩增后病毒滴度为2.3×10~(10) pfu/mL,感染bMGEs的MOI为10~20。 5.实验比较了质粒载体(pEGFP-hTERT, pCI-neo-hTERT)和腺病毒介导的hTERT(Ad-hTERT)转染bMGEs的转染效率、阳性克隆率,结果表明Ad-hTERT感染bMGEs的效率是76±1%,pEGFP-hTERT转染bMGEs的效率仅有33±2%;经6-8次重复试验Ad-hTERT阳性克隆率50%,pEGFP-hTERT和pCI-neo-hTERT阳性克隆率为0。结果表明:重组腺病毒Ad-hTERT和质粒载体相比,具有高的转染效率和阳性克隆率。 6.利用流式细胞仪、免疫荧光、实时定量PCR、Western blot、细胞增殖实验、TRAP-PCR等方法证实重组腺病毒介导的hTERT不仅能够刺激能bMGEs的体外增殖,而且维持了bMGEs的原始特性。尽管由于腺病毒不整合宿主染色体使得hTERT在bMGEs仅能够维持表达不到15代,但hTERT-bMGEs体外存活延长40代以上。 7.通过Southern blot检测发现, hTERT-bMGEs中第5代,12代,18代,27代的端粒平均长度(TRF)为17.73 kb±0.80 kb,对照组第4代bMGEs中TRF为16.43 kb,第13代bMGEs的TRF仅为13.4 kb,结果表明端粒酶通过延长端粒长度来维持处于增殖旺盛的早期hTERT-bMGEs的寿命,在后期,p21WAF1-p53信号通路发生变化,表明端粒酶可能引发一些抑癌基因和转录因子的下调,从而促进后期没有端粒酶活性的hTERT-bMGEs的增殖。 8.利用人溶菌酶乳腺特异性表达载体转染hTERT-bMGEs ,结果表明hTERT-bMGEs能够提高乳腺特异性表达载体的转染效率和阳性克隆率,在激素刺激下人溶菌酶在hTERT-bMGEs能够有效分泌表达。结果表明hTERT-bMGEs能够有效地用于评估乳腺特性表达载体的功能。 9.以hTERT-bMGEs作为供核细胞,观察核移植重构胚的发育情况及胚胎质量,通过第18代和28代的hTERT-bMGEs比较结果发现不同代数的核供体细胞对核移植胚胎的发育率无显著影响,但是相比较第10代bMGEs,第28代的hTERT-bMGEs具有高的囊胚发育率和较高胚胎质量,结果证明hTERT-bMGEs可以作为体细胞核移植的供核细胞。


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