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凡纳滨对虾肌肉组织中体重调控相关基因的筛选、克隆鉴定及功能研究

李喜莲  
【摘要】:由于对虾养殖业在世界范围内迅速扩张,凡纳滨对虾正成为一个重要的经济物种。随着养殖技术的不断提高和抗病性的增强,通过遗传改良来提高虾的养殖速度已成为一个重要的技术。这有可能降低养成周期的长度,从而降低生产成本,缩短对虾养殖周期。但是目前有关对虾肌肉增长的相关基因,特别是调控基因,目前还不是很清楚。 本研究以凡纳滨对虾雌虾极端体重个体腹部肌肉为实验材料,利用抑制消减杂交(SSH)技术构建极大体重个体和极小体重个体正反向消减cDNA文库、鉴定和克隆了差异表达的基因,并采用实时定量技术分析筛选出的体重调控相关基因的表达规律,利用生物信息学对其功能和结构进行预测,而且对筛选出的体重调控相关基因在肌肉组织的表达量和体重十个指标进行了相关性分析,同时构建原核表达载体,研究了RAS、P23和Troponin基因在大肠杆菌中的表达情况,为凡纳滨对虾的功能基因克隆和分子选育等研究奠定基础。本研究取得以下结果: 1.利用SSH技术构建极大体重雌性个体和极小体重雌性个体腹部肌肉组织正反向消减cDNA文库:正库(以极大体重个体为试验组,以极小体重个体为驱动组,L-S)和反库(以极小体重个体为试验组,以极大体重个体为驱动组,S-L)消减cDNA文库,以β-actin为看家基因检测两个文库的消减效率分别为2~(10)和2~5,说明差异表达在极大体重个体和极小体重差异基因在文库中的富集效率为2~(10)和2~5。 2.从S-L消减cDNA文库中挑出50个克隆,筛选出30个大小合适的阳性克隆进行测序。测序获得18个EST序列,其中14个为凡纳滨对虾已知基因,4个为凡纳滨对虾未知基因,但与其他物种同名基因同源性达95%以上。这18个基因分别是:延伸因子1α,NADH脱氢酶亚基(1、2),细胞色素c氧化酶亚基(2B、Ⅱ、Ⅲ),热休克蛋白90,高血糖激素,腺苷酸激酶,亚型原肌球蛋白,核糖体蛋白31,核糖体蛋白S24,肌钙蛋白C。 从L-S消减cDNA文库中挑出150个克隆,筛选出100个大小合适的阳性克隆进行测序。测序获得49个EST序列,其中19个为凡纳滨对虾已知基因,19个为凡纳滨对虾未知基因,但与近缘物种具有较高的同源性。另有11个为线粒体序列,其差异基因主要包括:组织或细胞成分合成的cDNA序列为序列总数的37.21%;细胞生长或修复的cDNA序列,所占比例为13.93%;绑定蛋白、生物调节、催化活性相关的cDNA序列,占序列总数的4.65%、4.65%、4.65%。 对S-L消减cDNA文库中的AK、CHH和Troponin基因片段进行实时定量分析,结果表明三个基因在大体重个体肌肉中的表达量低于在小体重个体肌肉中的表达量。挑选L-S消减cDNA文库中的CTSL、ER、FABP、P23、PK、PRDX、TM、RAS、VTG这9个基因片段进行实时定量分析,结果表明:这9个基因在极大个体肌肉中的表达量高于极小个体中的表达量。同时,实时定量分析结果表明:AK、CHH和Troponin基因在体重的调节中起下调作用,而CTSL、RAS、TM等其余9个基因在体重的调节中起上调作用。 3.根据不同物种之间的基因编码区的保守性,设计引物并成功克隆了凡纳滨对虾RAS、P23和Troponin的基因,均包括完整的编码区序列,其GenBank登陆号分别为:RAS(ORF 564bp,GenBank No:JF806618)、P23(ORF 495bp,GenBank No:JF806619)和Troponin(ORF 480bp,GenBank No:JF806620)。本研究利用多个生物信息学的分析软件,对筛选出的差异表达的3个基因RAS、P23和Troponin进行氨基酸结构和潜在功能位点的预测,同时进行了蛋白质的二级和三级结构的预测和分析。结果发现RAS蛋白部分序列有强疏水性,且有强疏水结构域。P23蛋白也有部分序列有强疏水性,无跨膜螺旋结构,两种信号肽预测都显示P23含有信号肽,第12个氨基酸处存在信号肽的可能性是92%。Troponin蛋白无疏水性序列,在6-24氨基酸处有强跨膜螺旋结构,无信号肽区域。 4.本实验对12个基因在凡纳滨对虾不同性别间表达量差异的分析中发现VTG基因不仅在雌虾肌肉中表达,在雄虾肌肉中也有表达,这一结果与前人研究不一致。对12个基因在五个组织(眼柄、心脏、肝胰腺、胃和消化道)的mRNA表达量研究中发现,AK在心脏和胃组织上的表达量最高,而CHH却在心脏和胃组织上的表达量最低,Troponin基因在肌肉上表达量最高,这些都与其功能有关。对9个基因与体重十个性状的相关性分析发现,AK、PK和TM这三个基因的相对表达量与其他基因都不相关,而只有VTG基因与体重呈负相关,且相关系数最高的两个基因为CHH和ER,这两个基因均为与对虾蜕皮有关(R~2=0.795)。 5.将RAS、P23和Troponin基因的编码区构建到pET32a (+)载体中进行原核表达,研究结果显示在大肠杆菌BL21中成功表达了RAS和Troponin蛋白;优化后的表达条件为30℃,1mmol/L IPTG诱导6h;而重组质粒pET32a (+)-P23在BL21(DE)中未能表达成功。


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