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棉花叶片衰老相关基因的数字化表达谱分析

王丹  
【摘要】:棉花是重要的经济作物之一,棉花叶片早衰严重影响棉花的产量。阐明棉花叶片衰老的机制、延缓叶片衰老是提高棉花产量的关键。但是,目前关于棉花叶片衰老的研究主要集中在生理生化水平,对大规模的基因表达和调控机制的研究还不清楚。因此,开展对棉花叶片衰老相关基因的表达谱的研究有重要的现实和理论意义。本研究以短季棉中棉所10号为材料,利用数字化表达谱技术在基因水平上大规模分析棉花叶片衰老,目的是为进一步探索棉花叶片衰老的机制奠定基础。本研究的主要结果如下: 1、根据叶片的外部形态特征及对叶片叶绿素和丙二醛含量的测定,将叶绿素含量最大值时的20天的叶片作为未衰老样品,将叶绿素含量为最大值的70%时的45天的叶片作为衰老样品,构建两个表达谱文库;将20天、45天、50天和55天的叶片作为荧光定量分析所用的样品。 2、通过初级分析,在未衰老文库和衰老文库中分别得到3,528,857和3,598,523原始的tags,去除没有意义的tags后,分别得到了111,672和142,655 clean tags,将这些clean tags的数量和种类随着clean tags的拷贝数的分布变化情况进行统计,结果发现:clean tags的数量与拷贝数正相关,当拷贝数大于100时,达到clean tags数量的最大值;clean tags的种类数与拷贝数负相关,最大值出现在[2,5]区间内。 3、选择DFCI(Dana-Farber Cancer Institute cotton transcript database)作为参考基因数据库,将两个表达谱文库中的clean tags分别与参考基因数据库进行注释,分析对象为只注释到1个参考基因上并且注释到这个参考基因正义链上的clean tags。结果得到在未衰老文库(M)和衰老文库(S)中符合标准的clean tags的数量和种类分别占25.75% (M)、28.59% (S);19.71% (M)和18.85% (S)。没有注释到参考基因数据库中的clean tags的种类超过了50%,这也表明clean tags拷贝数在[2,5]区间时的注释效率很低。 4、通过对差异表达基因的分析,鉴定到了3218个上调表达的基因,以Q-value≤0.05和corrected p value≤0.05作为标准,分析pathway和GO过程,结果得到了2个显著性的pathways和11个参与器官衰老过程的上调基因,并且在这些上调基因中还鉴定到了许多与激素和调节相关的基因,其中包括参与赤霉素、乙烯、茉莉酸、脱落酸合成的关键基因。 5、根据差异基因的上调变化倍数和基因的功能注释,研究筛选了17个基因进行荧光定量分析,用tubulin beta-5 chain作为内参基因,这17个基因的荧光定量结果显示:15个基因与表达谱的结果一致,都在45天的衰老叶片中上调表达,有2个基因在45天时表现下调,但是其中一个基因在55天时却是上调表达的,符合在衰老叶片中上调表达的趋势,另一个基因不是真正的上调表达基因。 6、将棉花叶片衰老相关基因与叶片衰老数据库中18种植物的叶片衰老相关基因进行同源性分析,结果得到196个与拟南芥同源的基因,9个与水稻同源的基因,与苜蓿、红藜、大豆、豌豆、番茄和烟草同源的基因各有1个,并且发现这些同源基因主要是参与大分子降解、转录调控、激素代谢和营养物质循环再利用的途径。 7、用浓度为30μg·μL~(-1)和100μg·μL~(-1)的外源赤霉素处理棉花苗,分析赤霉素对棉花叶片衰老相关基因表达的影响,结果表明:高低两种浓度的赤霉素处理都可抑制NAP、SAG18的表达,但是在处理6小时后却能促进乙烯合成关键基因ACS6的表达,推测赤霉素可能通过乙烯的协同作用参与棉花叶片的衰老。


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