收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

日本血吸虫Wnt4信号分子作用机制及β-连环蛋白基因克隆的研究

李红飞  
【摘要】:血吸虫病是一种世界性分布的人畜共患寄生虫病,对人类和哺乳动物健康造成极大威胁。血吸虫病在我国主要流行于长江以南部分山地和沼泽地区,目前中国血吸虫病研究的重点是阐明日本血吸虫生长发育机制,寻找其中关键的信号分子、酶和受体等,为新型疫苗和药物的开发提供依据。相关人员利用生物信息学方法预测日本血吸虫体内存在Wnt信号通路,该信号通路作用机制高度保守,参与调控多种生理学过程。前期研究克隆了日本血吸虫首个Wnt家族基因Wnt4,该基因在哺乳动物体内主要参与调控生殖器官发育,但该基因在日本血吸虫虫体生长发育中是否有类似作用及发挥作用的分子机制需要进一步阐明。 本文以揭示日本血吸虫Wnt4分子的作用机制为目标,分析了Wnt4基因的结构特征及其在不同发育阶段虫体转录水平的变化;制备了抗Wnt4血清,对该蛋白进行虫体定位;利用RNAi技术证明Wnt4信号分子通过经典Wnt/β-catenin信号通路参与调控虫体表皮生长和雌虫产卵过程;克隆了日本血吸虫经典Wnt信号通路的关键分子β-catenin基因cDNA序列,分析了其典型结构特征和不同发育阶段转录水平的变化。 1. Wnt4基因的结构特征和不同发育阶段虫体转录水平变化 以限制性内切酶消化的日本血吸虫基因组DNA为模板,构建GenomeWalker~(TM)文库;设计特异引物扩增Wnt4基因的DNA片段,与其cDNA序列进行比对,证明Wnt4基因序列包含4个外显子和3个内含子。以18S rRNA为内参,通过实时定量PCR分析Wnt4基因在虫卵、发育早期阶段童虫和23日龄雌、雄虫的转录水平相对较高。 2.抗Wnt4血清的制备和Wnt4蛋白的组织定位 以Wnt4基因的部分cDNA序列为目的片段,设计特异引物进行PCR扩增;将PCR产物和pET28a(+)载体分别进行双酶切后连接,构建pET28a-Wnt4-156重组质粒,诱导表达Wnt4原核蛋白片段;以纯化蛋白为抗原,免疫BALB/c小鼠,制备抗Wnt4血清;Western blotting验证该血清能够和虫体Wnt4蛋白特异结合。 以制备的抗血清为一抗,免疫组化分析表明该蛋白在32日龄成虫的生殖器官(雄虫睾丸和雌虫卵巢)并无分布,而是主要定位于13日龄童虫、18日龄童虫和32日龄成虫体壁下的肌肉细胞层,且随着日龄增多,蛋白量有下降趋势,推测该蛋白对虫体生殖系统的调控作用并不显著,可能参与表皮相关的发育过程。 3. RNA干扰技术研究Wnt4信号分子的作用通路 利用在线RNA干扰软件设计4个候选siRNA分子,荧光显微镜观察电击法能够将FAM标记的siRNA导入虫体;用电击法筛选干扰效果最好的siRNA,作为应用干扰小分子;比较了电击法和浸泡法对Wnt4基因的抑制水平,表明电击法和浸泡法均能有效抑制目的基因的表达,但电击法引起的抑制效果约是浸泡法的2倍;剂量分析表明50μg和40μg siRNA引起的抑制效果无统计学差异,但50μg剂量能够引起虫体大量死亡,因此在下游基因分析中采用40μg作为应用剂量。 根据预测的日本血吸虫Wnt信号通路,分别选择3条通路的6个下游基因,以干扰后体外培养7 d的虫体为研究对象分析下游基因表达量的变化。结果表明试验组虫体β-连环蛋白(β-catenin)和糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)的mRNA水平分别下降了45%和39%,这两个基因是经典Wnt信号通路的下游基因,其它4个基因的mRNA水平无明显变化,证明Wnt4分子通过经典的Wnt/β-连环蛋白信号通路起作用。Western blotting分析表明试验组虫体Wnt4和β-连环蛋白的蛋白水平也明显下降。 4. Wnt4信号分子在虫体发育过程中的作用 将干扰siRNA导入新转化童虫,使童虫在小鼠体内完成发育过程。分析表明试验组和对照组虫体的发育率和合抱率无显著差异,但试验组雌、雄虫的体长明显小于对照组雌、雄虫,试验组小鼠肝脏荷虫卵率明显低于对照组小鼠。推断Wnt4信号分子在虫体发育过程中的作用之一是调控虫体表皮细胞生长和雌虫产卵过程。 5.β-连环蛋白基因cDNA序列的扩增和不同发育阶段虫体转录水平的变化 通过RACE技术得到日本血吸虫经典Wnt信号通路的关键分子β-连环蛋白基因的全长cDNA序列(GU570442),在线软件分析该蛋白有β-连环蛋白家族蛋白典型的ARM结构特征。实时定量PCR分析表明该基因在不同发育阶段虫体转录水平变化趋势和Wnt4基因有相似性。 以上研究证明在日本血吸虫体内Wnt4信号分子通过经典的Wnt/β-连环蛋白信号通路参与调控虫体表皮生长和雌虫产卵过程,Wnt4信号分子作用机制的阐明为研究日本血吸虫的生长发育机制和寻找新的药靶位点提供了新的思路和研究方向。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 程天印 ,施宝坤;日本血吸虫排卵规律的研究[J];信阳农业高等专科学校学报;1991年02期
2 施福恢,沈纬,田锷,叶萍,蔡学忠,钱承贵,林邦发,傅志强,刘金明,石耀军,陈永军,李浩,张正达,吴祥甫,蔡幼民,M.Taylor,M.C.Huggins,Q.D.Bickle;日本血吸虫重组抗原Sj GST Paramyosin 和 Sj 23对绵羊的保护性免疫试验[J];中国兽医科技;1997年11期
3 黄复深,易新元,曾宪芳;日本血吸虫丝氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆和分析[J];中国兽医科技;2003年12期
4 杨德君,毛湘冰,文扬;日本血吸虫免疫学研究的进展[J];上海畜牧兽医通讯;2005年03期
5 毕晓云,周述龙,李瑛;钉螺体内日本血吸虫尾蚴发育期的形态及其扫描电镜观察[J];动物学报;1991年03期
6 袁鸿昌,E.S.乌伯坦,M.柯汝察巧,V.昆苞丽万;东方人类血吸虫及其螺蛳宿主交互感染的研究[J];动物学报;1989年02期
7 周蕊,缪德强,张一伟,韩跃,张声海,朱瑞淑;单克隆抗体抑制性酶联免疫吸附试验(I-ELISA)检测日本血吸虫虫卵抗原[J];四川动物;1989年01期
8 施福恢,林矫矫,沈纬,李浩,石耀军,陆珂,左新,丁福先,何秉宁,赵克勤,王文忠,宋建平,魏向阳,王德吾;日本血吸虫DNA疫苗对黄牛的田间免疫试验[J];中国兽医科技;2002年08期
9 傅志强,田锷,林邦发;中国大陆不同地区日本血吸虫虫卵抗原的比较研究[J];中国兽医寄生虫病;1995年04期
10 杨元清,吴嘉彤,张超威,常正山;罕见的日本血吸虫畸形[J];中国兽医寄生虫病;1996年02期
11 熊孟韬,杨光荣,吴兴,陶开会,吴鹤松,蔡文凤;永胜县山区鼠类感染日本血吸虫调查研究[J];医学动物防制;2000年02期
12 田欣田;史学增;邱震东;孙彩霞;夏志平;;血防制剂对实验性兔日本血吸虫的扫描电镜观察[J];畜牧与饲料科学;1993年03期
13 王过渡,望西玉;日本血吸虫雄性成虫的细胞电活动特征的研究[J];动物学报;1994年02期
14 何毅勋,施福恢;免疫和非免疫耕牛感染日本血吸虫后虫卵肉芽肿大小的比较(英文)[J];中国寄生虫学与寄生虫病杂志;1994年03期
15 林矫矫;中国大陆株日本血吸虫23kD基因重组抗原的研究──23kD抗原大亲水区多肽基因重组抗原的制备及抗原性测定[J];中国兽医科技;1995年05期
16 董艳德;陈尔曼;;日本血吸虫基因差异表达研究进展[J];湖南畜牧兽医;2008年05期
17 何毅勋,许绶泰,施福恢,沈纬,S.Y.LiHsü,H.F.Hsü;黄牛与水牛感染日本血吸虫的比较研究[J];动物学报;1992年03期
18 林矫矫,田锷,叶萍,傅志强,施福恢,石躍军,达陈永军,林邦发,钱承贵,张正达;日本血吸虫谷胱甘肽S-转移酶小鼠免疫试验[J];中国兽医寄生虫病;1996年01期
19 周艳琴,姚宝安,夏雪山,赵俊龙,孙明,俞子牛;苏云金杆菌晶体蛋白不同给药途径对小鼠体内日本血吸虫的作用[J];中国兽医学报;2002年02期
20 郝力力;李锐;郑威;;日本血吸虫内源性siRNAs的研究[J];安徽农学通报(上半月刊);2011年15期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 王欣之;矫矫;石耀军;冯新港;苑纯秀;金亚美;;日本血吸虫7d童虫消减cDNA文库的构建及测序分析[A];第二届全国人畜共患病学术研讨会论文集[C];2008年
2 苏斌涛;刘文琪;;日本血吸虫感染小鼠体内IL-17的动态变化研究[A];中华医学会第九次全国检验医学学术会议暨中国医院协会临床检验管理专业委员会第六届全国临床检验实验室管理学术会议论文汇编[C];2011年
3 付媛;张雪娟;卢福庄;石团员;;日本血吸虫融合蛋白2LHD-Sj23原核表达载体的构建和表达[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
4 张艳丽;赵犇鹏;李莹;杨健美;苑纯秀;冯新港;;日本血吸虫鞘脂激活蛋白原T细胞免疫原性研究[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
5 陈启军;郝力力;蔡鹏飞;;日本血吸虫小RNA(snRNA)转录组研究[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十次学术研讨会论文集[C];2009年
6 易新元;曾宪芳;蔡春;张冉;陈欲晓;曾宪忠;田明礼;;日本血吸虫DNA疫苗的研究[A];中国动物学会全国第九次寄生虫学学术讨论会论文摘要集[C];2003年
7 姜宁;武闯;陈启军;;日本血吸虫23kDa膜蛋白(Sj23)与人免疫球蛋白的相互作用分析[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
8 戴洋;朱荫昌;王晓婷;唐建霞;赵松;;日本血吸虫核酸疫苗体内电穿孔法的进一步研究[A];2011新型疫苗与抗体创制关键技术及质量控制研讨会论文集[C];2011年
9 张旻;韩艳辉;朱珠;李东;洪炀;吴秀娟;傅志强;林矫矫;;日本血吸虫体被表膜蛋白磷酸二酯酶-5(NPP-5)基因的研究[A];中国畜牧兽医学会家畜寄生虫学分会第六次代表大会暨第十一次学术研讨会论文集[C];2011年
10 朱俊勇;董惠芬;蒋明森;钟沁萍;张兆仁;胡世全;;细胞外基质促日本血吸虫培养细胞贴壁的研究[A];中国动物学会全国第九次寄生虫学学术讨论会论文摘要集[C];2003年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 何原;日本血吸虫酚氧化酶基因结构及其功能的研究[D];武汉大学;2012年
2 陈岩勤;白头翁总皂苷对日本血吸虫及其宿主的作用和机制研究[D];苏州大学;2013年
3 杨健美;不同终末宿主对日本血吸虫感染适宜性的差异分析[D];中国农业科学院;2012年
4 刘镕;日本血吸虫骨形成蛋白分子的鉴定和功能研究[D];武汉大学;2013年
5 胡元生;日本血吸虫酪氨酸羟化酶信号通路的干预[D];安徽医科大学;2009年
6 洪炀;日本血吸虫童虫在不同敏感性宿主体内差异表达蛋白的研究[D];南京农业大学;2011年
7 卢艳;日本血吸虫诊断抗原的筛选、鉴定及初步评价[D];华东理工大学;2012年
8 陈晓军;日本血吸虫病患者肝脏病理损害的免疫学诊断方法的建立及相关机制探讨[D];南京医科大学;2013年
9 唐桂霞;日本血吸虫虫源抗原与抗原递呈细胞的相互作用的(体外)实验研究[D];南京医科大学;2010年
10 鞠川;基于功能基因组的日本血吸虫病诊断靶点的筛选和鉴定[D];华中师范大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 罗秀菊;日本血吸虫重组亚单位疫苗的研究[D];中南大学;2003年
2 何谐;日本血吸虫与斯氏狸殖吸虫的遗传特征和特异性免疫诊断抗原研究[D];第三军医大学;2010年
3 武闯;日本血吸虫23kDa膜蛋白与人免疫球蛋白的相互作用分析[D];吉林大学;2011年
4 贾侃;基于功能基因组学数据的日本血吸虫候选疫苗分子的预测及初步鉴定[D];上海师范大学;2010年
5 邹镇;日本血吸虫23KD膜蛋白的原核表达与纯化及双价膜锚定型和分泌型表达疫苗抗感染效果的比较研究[D];华中科技大学;2009年
6 张鹏;日本血吸虫Tsunagi样蛋白编码基因功能的鉴定[D];安徽医科大学;2010年
7 王素娟;日本血吸虫SJCHGC06868蛋白的研究[D];中国农业科学院;2010年
8 杨巧林;药物(PZQ)压力下日本血吸虫的耐药性诱导及抗血吸虫新药的筛选[D];苏州大学;2010年
9 刘亚平;日本血吸虫感染小鼠肝星状细胞的功能研究[D];南京医科大学;2010年
10 张艳丽;日本血吸虫鞘脂激活蛋白原T细胞免疫原性及功能研究[D];中国农业科学院;2011年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 耿挺;解开血吸虫生存秘密[N];上海科技报;2006年
2 刘志国;委员又谈瘟神事[N];人民政协报;2006年
3 记者 任荃;解读血吸虫“生命密码”[N];文汇报;2006年
4 记者 曹玲娟;1300多个血吸虫特有基因被找到[N];人民日报;2006年
5 记者 曹玲娟;我科学家公布日本血吸虫“基因天书”[N];人民日报;2006年
6 冯立中;告别耕牛[N];健康报;2006年
7 本报记者 王璐;“送瘟神”任重道远[N];保健时报;2008年
8 李天舒;气候变暖可加剧血吸虫病传播[N];健康报;2008年
9 湖南中医学院附二医院教授 熊之焰;预防大肠癌的三部曲[N];大众卫生报;2005年
10 颜秋雨;李岳生让世界凝视洞庭[N];健康报;2006年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978