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西北地区苦马豆根瘤中内生细菌遗传多样性及其促植物生长特性的研究

邓振山  
【摘要】:苦马豆(Sphaerophysa salsula (Pall.) DC)是生长于我国西北荒漠区重要的野生豆科植物。本文采集了甘肃省和宁夏回族自治区两个不同生态区中6个样地的苦马豆根瘤样品,并采用16S rRNA基因RFLP,16S rDNA全序列分析,ERIC-PCR和nifH遗传型分析方法,对从4种不同培养基上分离得到的65株内生菌(或非共生菌)和50株共生菌进行了多样性分析和系统发育研究。用主成分分析(PCA)和相关分析(CA)对根瘤中的内生细菌遗传型的多样性与其不同的地理来源之间的关系进行了系统研究。并且鉴定了这些细菌对苦马豆促生长作用和结瘤效率的影响。 16S rDNA的PCR-RFLP的分析结果表明,115个菌株的4种内切酶酶切图谱类型组合共有25种。对每种图谱类型的代表菌株进行了16S rDNA全序列分析,其中共生的根瘤菌分别归属于中华根瘤菌属(Sinorhizobium)、根瘤菌属(Rhizobium)、中慢生根瘤菌属(Mesorhizobium);其余的内生菌分别归属于副球菌属(Paracoccus)、鞘脂单胞菌属(Sphingomonas)、固氮螺菌属(Inquilinus)、假单胞菌属(Pseudomonas)、沙雷氏菌属(Serratia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)、诺卡氏菌属(Nocardia)、链霉菌属(Strptomyces)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、短短芽孢杆菌属(Brevibacillus)、Lysinibacillus、葡萄球菌属(Staphylococcus)和芽孢杆菌属(Bacillus),这表明苦马豆根瘤中内生细菌具有丰富的多样性。经过比对16S rDNA近全长的序列(1337-1491nucleotides),表明65株内生菌具有丰富的遗传多样性,并分别归属于3个不同的门:变形菌门(Proteobacteria,革兰氏阴性菌,放线菌门(Actinobacteria)和厚壁菌门(Firmicutes,革兰氏阳性菌)。在变形菌门中有4个菌株属于α-变形菌纲(Paracoccus, Sphingomonas, Inquilinus);11个属于γ-变形菌纲(Pseudomonas和Serratia)。有6个菌株分别归属于放线菌门中的Mycobacterium, Nocardia和Streptomyces。有45株分别归属于厚壁菌门中的Paenibacillus, Brevibacillus, Staphylococcus, Lysinibacillus和Bacillus,其中芽孢杆菌属是优势根瘤内生菌,占苦马豆根瘤中所有内生细菌的58.5%。基于16S rRNA基因序列的系统发育分析表明,38株芽孢杆菌分别归属于5个种(B.simplex, B. safensis, B. cereus, B. Pumilus, B. licheniformis)。Serratia plymuthica, Lysinibacillus fusiformis和Staphylococcus saprophyticus这几个种是以前尚未从植物根瘤中分离到的内生菌种类。Mesorhizobium作为这种野生豆科植物共生细菌的优势种类,其菌株数占到所有根瘤菌总数的64%,在系统发育上它包括:M. amorphae, M. gobiense, M. tianshanense和M. mediterraneum这些种。 ERIC-PCR指纹图谱显示:每株菌经ERIC-PCR产生了特定的条带,从6-15条不等,片段大小为0.2到2.0 kb。在115株菌株中,经鉴定共形成了57种不同的ERIC图谱类型。在83%的相似率水平上,聚类分析将115株菌株归为17个不同的类群。其中50株共生细菌被分为9个类群(1-9)和3个单独类群;65株内生菌分为8个类群(10-17)和4个单独类群。ERIC-PCR经过聚类的分群结果,除少数例外,与16S rRNA基因RFLP的分析结果基本一致。 NifH基因的PCR扩增结果表明:从供试的根瘤菌菌株和内生菌菌株Bacillus pumilus Qtx-10中扩增出了nifH基因序列,而且其序列与Mesorhizobium sp.最为接近。通过比对,菌株Bacillus pumilus Qtx-10的nifH基因序列与Mesorhizobium albiziae最为相似,相似率为96.14%。 应用主成分分析(PCA)对样地理化性状进行了分析,除根瘤菌外,在本研究中,大多数ERIC类型出现在它们特定的样地。此结果充分证实了根瘤中的内生菌基因背景与其地理来源之间具有一定相关性。苦马豆根瘤中内生细菌种群分布取决于它们的生态适应性,而且主要与样地土壤C/N比、土壤pH值和海拔高度相关。因此,C/N比、土壤pH值和海拔高度可能是影响根瘤中非共生细菌和共生细菌群落结构和分布的重要因子。应用相关性分析(CA)对分离到的菌株的RFLP类型与它们的地理来源之间的关系进行了统计分析,结果显示按照它们的地理来源可以归为3个群。RFLP类型与它们的地理来源(采样地)之间具有明显的相关性,而且其聚类结果与样地作为变量的主成分分析结果是明显一致的。 本研究结果表明:有7个不同属的内生菌可以和Rhizobium在3个样地共存;4个不同属的内生菌可以和Sinorhizobium在1个样地共存;13个和Mesorhizobium在6个样地共存。而且,Bacillus的高分离频率(0.833)也证实了在苦马豆根瘤中内生菌与共生菌共存现象是普遍存在的。 本研究表明,在17株代表菌株中,有13株显示了促植物生长的特性。当与根瘤菌Mesorhizobium gobiense Zw-19混合共同接种时,它们都能够明显的提高接种植物体的叶绿素含量、植株鲜重、植株高度、植株结瘤数和根瘤平均鲜重等。接种Qtx-10可以把植株鲜重提高87.5%,Gt-10增加株高达89.4%。菌株Qtx-10和Gzn-9-1同时表现出产IAA、铁载体和抑制病原真菌生长的特性。只有菌株Qtx-10,Gzn-9-1和Zw-13-3的接种物,可以引起植株根毛变形,并在根尖部位形成泡状结构。 菌株Paracoccus sphaerophysae Zy-3T为革兰氏阴性、不能运动,菌体细胞中不含芽孢。经过16S rRNA基因序列比对分析,结果表明与菌株Zy-3T相似率最高的是菌株Paracoccus halophilus HN-182T (96.6%的相似率),依据表现型和基因型的研究,结果表明该菌株代表着副球菌属中的一个新种。 菌株CCNWQtx-14T为革兰氏阴性、能运动,菌体细胞中不含芽孢。经过16S rRNA基因序列比对分析,结果表明与Rhizobium giardinii和Rhizobium daejeonense的相似率分别是95.8%和95.6%,该菌株代表着Rhizobuim属中的一个新种。


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