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脐橙螟蛾对植物源挥发气味物质的感受机制

刘召  
【摘要】:脐橙螟蛾Amyelois transitella (Walker)是美国加利福尼亚州开心果、杏仁、核桃的重要经济害虫,以幼虫蛀食坚果果肉,在生产和储藏过程中均可危害,常造成严重的经济损失。由于其隐蔽的取食特性,该害虫难以防治,目前的防治手段仅限于果园内农事操作及喷洒化学药剂进行虫口压制。研究A. transitella的化学感受机制,阐明其与寄主植物之间的相互关系,探索新的化学生态学防治手段,对于A. transitella的控制有着重要的理论和实践意义。 本文首先表达并纯化了A. transitella两种普通气味结合蛋白AtraGOBP1和AtraGOBP2,研究了这两种蛋白与植物源挥发物的作用机制。同时,利用电生理手段(触角电位仪技术)测定了A. transitella化学感受的电生理反应,并对A. transitella化学感受机制进行了探讨。在此基础上,在室内和田间检测了由这些挥发气味物质制成的诱捕器对该害虫产卵行为的影响,为利用这些化学挥发气味物质进行害虫的检测和防治进行了基础性研究。主要结果如下: 1.利用LB培养基在转入AtraGOBP1和AtraGOBP2基因的大肠杆菌Escherichia coli中成功的表达了AtraGOBP1和AtraGOBP2蛋白。LB培养基中的大肠杆菌细胞经过高速离心后并在液氮中经三次冻融裂解细胞,利用Tris-HC1缓冲液提取目标蛋白,高速离心去除细胞残体,在蛋白快速纯化仪(FPLC)上用DEAE, Q-Seph, MONO Q, gel filtration等柱子成功纯化到这两种蛋白的高纯度(98%)蛋白晶体。 2.用高效液相色谱-电喷雾串联质谱(LC-ESI-MS)检测方法对AtraGOBP1和AtraGOBP2的结构研究表明:AtraGOBP1分子量为16897 Da(理论计算值为16903 Da), AtraGOBP2分子量为16161 Da(理论计算值为16166 Da)。这两种蛋白分别失去6个氢原子,使实际检测到的分子量比由氨基酸序列计算得到的理论值减小6 Da,说明这两种蛋白都进行了正确的折叠,分别合成了3对二硫键结构。利用圆二色谱仪(Circular Dichroism)检测发现AtraGOBP1和AtraGOBP2在193、209、223 nm处各出现一个波峰(谷),证明这两种蛋白与其它气味结合蛋白一样,都富含α螺旋结构;同时发现在pH7和pH 5.5的缓冲液中蛋白构象存在差异。 3.利用cold binding assay法检测发现:在pH 7情况下,两种普通气味结合蛋白AtraGOBP1及AtraGOBP2均能与植物源挥发物decanal和nonanal结合;而在pH 5和缓冲液对照中均没有发生结合。但对于linalool、1-phenylethanol、PAPE、IBAPE等化合物,由于在pH 5和对照中存在较高的背景,难以得出明确结论。为确定这些化合物能否与AtraGOBP1和AtraGOBP2结合,我们采用了fluorescence binding assay检测,结果表明,AtraGOBP1及AtraGOBP2能与decanal、nonanal发生明显的结合,而与linalool、1-phenylethanol、PAPE、IBAPE则没有明显的结合。 4.利用触角电位仪检测成虫触角发现:decanal、nonanal、linalool、1-phenylethanol、PAPE、IBAPE均能引发A. transitella雌、雄成虫的触角电生理反应,反应强度随着化合物浓度的升高而增大。对不同龄期的成虫触角对所测定的植物源挥发物的敏感度观察表明:在第0到4天中成虫触角对所测定的植物源挥发物均有较高的敏感度,而在第5天触角敏感度则明显降低。与气味结合蛋白与植物源挥发物结合试验比较表明,有其它气味结合蛋白参与信息素从外界环境到昆虫体内受体的转运。 5.为检测各种植物源挥发物质对成虫产卵行为的影响,将不同剂量(10μl x 10μg/μl,50μl x 10μg/μl,100μl xμl的待测植物源挥发物质的己烷溶液滴在滤纸上制成诱饵,并用湿润卫生纸保湿;然后将诱饵及交配后的15头雄成虫及10头雌成虫放入(60×60×60cm)的尼龙网中观测成虫产卵行为,结果表明linalool和1-phenylethanol在3种剂量下均能引诱A. transitella产卵,其余植物源气味挥发物质对产卵没有明显的诱集效果。大田生测结果表明:在50μl x 10μg/μl,100μl x 10μg/μl两个剂量下,linalool和1-phenylethanol在能引诱A. transitella产卵,而10μl x 10μg/μl剂量下,则不能诱发脐橙螟蛾产卵;而其它的植物源挥发物在所测定的剂量条件下,也不能诱发该害虫产卵。


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