中国西北地区甘草根瘤内生细菌多样性和系统发育研究

【摘要】：本文综述了根瘤菌和内生细菌的国内外研究进展以及所采用的先进研究方法,并对我国西北地区的环境特点和甘草的特性进行了描述。通过扩增片段长度多态性分析(AFLP)揭示了甘草根瘤内生细菌的多样性,采用结瘤试验和促生属性测定菌株对甘草生长的影响,应用辨别式分析(DA)和典范对应分析(CCA)对菌株的基因型与地理来源,寄主种类和环境因子之间的关系进行了系统研究,以及通过16S rRNA基因,持家基因(recA和rpoB)和共生基因(nodA,nodC和nifH)的全序列测定分析根瘤菌的系统发育地位,得出了如下主要结论: 本研究从我国西北地区四个省五种甘草中共分离到159株根瘤内生细菌,其中,115株来自于新疆,26株来自于陕西,13株来自于甘肃,5株来自于宁夏。大约60%的菌株(95株)分离自乌拉尔甘草,28株分离自光果甘草,8株分离自圆果甘草,6株分离自黄甘草,2株分离自胀果甘草,20株分离自未知种类的甘草。 AFLP和16S rDNA部分序列分析揭示我国西北地区甘草根瘤内生细菌具有丰富的多样性。在50%的相似性水平上,全部菌株被划分为7个AFLP群和4株单个菌株,在60%的相似性水平上可进一步划分为29个亚群。每个亚群代表不同的根瘤菌和非根瘤菌的种。其中,73%的菌株位于α-proteobacteria门,包括57株Mesorhizobium,25株Rhizobium,11株Sinorhizobium,6株Phyllobacterium,16株Agrobacterium和1株Rhodobacter;20%的菌株位于Firmicutes门,包括31株Paenibacillus和1株Microbacterium;还有6株菌位于γ-proteobacteria门,包括3株Erwinia,2株Pantoea和1株Enterobacter。 分离于甘草根瘤的内生细菌中,几乎所有Mesorhizobium属的菌株都能与供试的乌拉尔甘草和光果甘草形成根瘤并有效固氮,为优势共生菌;而Rhizobium和Sinorhizobium属的菌株与这两种甘草的结瘤固氮能力是随机的且不稳定,为偶然共生菌;其他内生细菌并不能使这两种甘草形成根瘤,为非共生菌。 非共生的内生细菌中,75%的菌株具有产IAA的能力,且Agrobacterium属的菌株最强;具有产铁载体和纤维素酶能力的菌株与IAA类似,分别为71%和77%;49%的菌株可以产生有机酸,但仅有6株菌具有溶磷能力;31%的菌株具有产蛋白酶的能力,且大部分为Paenibacillus属的菌株;供试菌株产脂肪酶能力最差,仅有4株,为Paenibacillus和Rhodobacter属的菌株。因此,甘草根瘤内生细菌中,一些菌株具有多种促进植物生长的属性,为潜在的植物生长促生菌。 DA分析表明甘草根瘤内生细菌的AFLP基因型分布与其地理来源和寄主植物之间具有一定相关性。按照它们的地理来源,74%的AFLP基因型被归为3个类型,即新疆北部(NX),新疆南部(SX)和我国中部(CC)。根据寄主植物的种类,82%的AFLP基因型被划分为4个类型,即乌拉尔甘草(G. uralensis),光果甘草(G. glabra),黄甘草+胀果甘草+圆果甘草(G. eurycarpa + G. inflata + G. squamulosa)和未知种类甘草(Glycyrrhiza spp.)。其中,根瘤菌AFLP基因型的划分尤其依赖于它们的寄主植物甘草的种类。CCA分析表明所用环境因子只能解释一小部分细菌基因型的分布规律,其总贡献率仅为8.4%,但仍提供了一些两者相关的线索。细菌基因型被划分为3个类型:AFLP 4d(Paenibacillus(P))的分布与纬度呈正相关而与年平均降雨量呈负相关;AFLP 4a和1a(Mesorhizobium - Rhizobium(MRGU))的分布与海拔高度呈正相关;而AFLP 3b和5e(Mesorhizobium(M))的分布与所分析的环境因子没有明显的相关性,但其分布可能受本研究未分析的环境因子的影响。另外,较低的年平均降雨量可能是导致新疆乌拉尔甘草根瘤中较多的Paenibacillus spp.存在的一个重要原因。 结合16S rRNA、recA和rpoB基因全序列分析,除个别菌株外,其系统发育树表现出大致相同的结果。分支Ⅰa在三个基因的系统发育树中均与M. tianshanense聚在一起,说明它为该种类。但分支Ⅰb,Ⅱ,Ⅲ和Ⅳ在三个基因的系统发育树中处于不同的分类地位,并与不同的已知种聚在一起,因此很难确定它们的准确分类地位,需要更多的持家基因参与。共生基因的系统发育树表明甘草Mesorhizobium根瘤菌的nifH基因具有丰富的多样性,并有可能蕴藏着新的共生基因。综合nifH,nodA和nodC基因全序列分析,其菌株间的系统发育关系较类似,表明不同的共生基因之间相关性很高。所有菌株根据地理来源和寄主种类形成不同的分支,表明来自于不同地区及不同甘草的菌株,其共生基因存在着差异,并表现出一定的生态型或生物地域型。