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小麦幼苗叶片水分胁迫差异表达蛋白研究及其候选基因克隆

范锋贵  
【摘要】:干旱是人类面临的严重生态问题之一,由于干旱造成的农业经济损失相当于其他自然灾害造成的损失之和。选育和推广抗旱品种是作物稳产高产持续发展最经济的途径之一,而揭示作物抗旱机理是其实现的基础。小麦是我国重要的粮食作物,受到水分胁迫后会产生或表达量增多一些蛋白,即水分胁迫应答蛋白。已有研究表明,此类蛋白与植物的干旱逆境适应具有密切关系。 本研究应用双向电泳技术从蛋白质组水平,对晋麦47幼苗叶片在-0.5MPa的PEG-6000溶液胁迫产生的差异表达蛋白进行鉴定;应用SDS-PAGE技术并结合质谱技术(MALDI-TOF/MS、LC-MS/MS),对晋麦47幼苗叶片的一个水分胁迫差异表达蛋白条带进行了质谱鉴定;利用基因克隆技术对鉴定得到的其中一个水分胁迫相关蛋白基因进行了克隆,主要研究结论如下: 1、应用双向电泳技术及质谱技术,分析了正常供水与-0.5MPa PEG-6000胁迫48h小麦品种晋麦47幼苗叶片差异表达蛋白质图谱。在可重复检测到的850±45个蛋白点中,有31个蛋白点在水分胁迫下发生明显的表达变化(1.5倍差异表达),其中14个蛋白点下调表达,17个上调表达。它们主要涉及了能量代谢、氨基酸代谢、光合作用、应激防御及信号转导等过程。 2、应用SDS-PAGE技术及LC-MS/MS质谱技术,对晋麦47中水分胁迫D-差异表达蛋白条带进行了分析与鉴定。在-0.5MPa PEG-6000水溶液胁迫下,该蛋白6h出现可见表达,胁迫至48h时表达量最大,随着胁迫时间的延长,此蛋白条带表达量又逐渐下降;幼苗胁迫48h后进行正常供水,复水72h后该蛋白消失;质谱分析分别获得两个阳性结果,且正常供水和PEG-6000胁迫两种处理条件下D-应答蛋白结果一致,均由核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基和磷酸甘油酸异构酶组成(P<0.05);PEG-6000胁迫条件下两个蛋白(亚基)的鉴定得分分别为1632、88,覆盖率分别为30%、21%,结果表明该蛋白条带可能主要由核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶大亚基组成。 3、应用基因克隆技术,以抗旱性不同的两份小麦品种晋麦47和西农2208为材料,对水分胁迫差异表达候选蛋白Rubisco小亚基基因进行了克隆。基因测序结果表明克隆片段长度为564bp,该基因内含子和外显子区在抗旱性不同的两个品种间均存在一个碱基的差异;氨基酸序列预测分析表明,两个碱基变异在两个品种间没有引起氨基酸序列差异。 本实验对国内大面积推广的旱地小麦品种晋麦47进行了干旱胁迫下的差异蛋白质组学分析,明确了参与干旱应激反应的蛋白质种类,对水分胁迫D-应答蛋白进行了质谱鉴定分析,并对候选蛋白进行了基因克隆,这有助于更好地探索小麦抗旱的分子机理,同时为小麦抗旱育种分子标记的开发提供了参考。


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