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猪细小病毒YL株全基因组序列分析及其VP2基因原核表达

时乐  
【摘要】:猪细小病毒(Porcine parvovirus, PPV)可以引起猪细小病毒疾病,该病是一种以母猪,特别是怀孕母猪发生不孕、流产、产出死胎、畸形胎、木乃伊胎以及病弱仔猪为特征的繁殖障碍性疾病。该病广泛存在于世界各地,给畜牧业生产带来了巨大的经济损失。目前,有关PPV全基因组的研究很少,GenBank中收录的完整PPV全基因组序列只有两条(Accession no. U44978和NC001718)。为了进一步分析PPV的基因结构特点和PPV的遗传变异情况,以及其在临床诊断中的应用,本研究首先以实验室分离的猪细小病毒YL株为材料,对其整个编码区序列进行测定,以分析猪细小病毒YL株基因组的分子特征,并对PPVYL株结构蛋白VP2的主要抗原表位区域进行原核表达,对其抗原活性进行评价。研究取得如下结果: 1.根据GenBank上公布的猪细小病毒全基因序列(NC001718),设计合成了覆盖PPV全部编码区的四对引物,利用PCR反应分段克隆PPV YL株的整个编码区基因片段,通过DNAStar软件对测序结果进行拼接,结果显示PPV YL株全长4302bp,且不存在碱基的插入与缺失,但碱基的突变覆盖整个基因结构。本研究结果已经被GeneBank收录,登录号为JN860197。 2.猪细小病毒YL株主要基因与其它国内外分离株进行比较,发现该毒株的NS1基因和编码蛋白与NADL-2(NC001718,5075bp)、NADL-2(M38367,5034bp)和Kresse(U44978)同源性最高,均达到99.4%。对PPV YL株VP2基因和蛋白的序列比对结果表明,YL株VP2基因与Kresse毒株(U44978)和我国的分离株BQ株同源性最高(99.7%),他们编码的氨基酸完全一致,结果表明猪细小病毒具有高度保守性。VP2基因和编码氨基酸差异分析表明YL株有可能和Kresse毒株具有相同的致病性。进化树分析表明PPVYL株与Kresse毒株和BQ毒株位于一个小分支,亲缘关系最近。 3.采用PCR技术利用试验中构建的含有PPV YL株VP2基因的阳性克隆质粒pGEM-YL-VP2进行VP2基因的特异性扩增,将其克隆到原核表达载体pET-32a中,构建原核表达载体pET-YL-VP2,经双酶切鉴定后将重组原核表达载体pET-YL-VP2转化到E.coli BL21,经过诱导条件的优化,目的蛋白通过IPTG诱导进行表达,SDS-PAGE结果显示,表达产物分子量为56Ku,经Western blotting检测具有良好的抗原活性。 本研究结果为建立分子生物学用于诊断猪细小病毒感染及研究该病的发病机制奠定基础。


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