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冻后牛精子活力与相关蛋白、基因表达关系的研究

王红  
【摘要】:人工授精技术(Artificial Insemination,AI)的广泛应用加快了动物的遗传选择并显著提高了生产力,随之发展起通过降低或者抑制精子新陈代谢达到在体外延长精子寿命目的的家畜精液保存技术。虽然牛冷冻精液与人工授精技术的结合已推广使用,但冷冻-解冻后仍然导致40%-50%的精子失去活性,不利于良种公牛种用价值的发挥。目前多数研究主要探索各种不同冷冻保护剂对精液的保护作用和适宜的添加比例,但缺乏相对的精子活力与基因和有关蛋白关系理论的研究,对他们的保护机理不甚明了。本试验利用WesternBlot技术初步探索了HSP90在牛精液冷冻过程中的变化趋势及其表达量与精子冻后活力之间的相关性,又利用实时荧光定量PCR技术研究了CSP、HSP60、HSP10、CIRBP这几种冷冻基因在冷冻前后的变化,结果发现HSP90对维持精子冻后活力具有重要作用,CSP基因可能也参与调控精子对冷应激的抵抗力。主要研究结果如下: 1.为了获得高浓度的精子蛋白,设计了不同精细管数与裂解液的搭配比例。结果显示4只细管裂解于200μl裂解液时,蛋白浓度最高,显著优于其他组(P0.05)。对冷冻前后精子和精浆中HSP90进行Western blot分析,得出精子中HSP90表达量在4℃平衡后基本无变化,在液氮中贮存一周后下降显著(P0.05),而精浆中HSP90一直不表达。初步研究结果表明,牛精子冷冻过程中精子蛋白HSP90表达量的下降是由蛋白质降解引起的,并非流失到精浆中。 2.探索HSP90不同表达量与牛精液冷冻-解冻后品质的关系。假阴道法采集9头荷斯坦奶牛精液,测定新鲜精液指标(活力、形态、活力和密度)。精液样品经过冷冻-解冻后检测其精子活力、质膜完整性和顶体完整性,并按冻后品质结果分为两组高冷冻抵抗力组(High freezing resistance teams, HFTs)和低冷冻抵抗力组(Low freezing resistanceteams, LFTs),精子蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳和Western blot检测,分析HSP90含量与精子抗冻性的关系。精液品质鉴定结果表明,不同牛个体间冻后精液品质相差较大。SDS-PAGE电泳显示,不同质量精子蛋白样品中,90ku蛋白表达量差异显著(P<0.05)。Western blot分析验证该蛋白为HSP90,HSP90的表达量与冷冻-解冻后的牛精子品质具有明显的正相关,其与精子活力、顶体完整性、质膜完整性的相关系数分别是0.364、0.447和0.402。HSP90表达量可以作为判断牛精子抗冻性的指标之一。 3.本研究利用荧光定量PCR技术检测这几种基因在牛精子冷冻前后表达量的差异,结果表明冷冻后CSP、HSP60和HSP10基因mRNA的表达量增加,其中CSP基因的表达量在冷冻后显著高于冷冻前(P﹤0.05),HSP60和HSP10基因冷冻前后差异不显著(P>0.05);而CIRBP基因mRNA的表达量减少,在冷冻前后差异不显著(P>0.05)。


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