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辣椒多聚半乳糖醛酸酶基因(CaPG)在茄科植物上的表达与功能分析

Shahjahan Shabbir Ahmed Rana  
【摘要】:近几十年来,辣椒在国际贸易中地位日渐增长,但其果实极易腐烂变质、失去食用价值。在发达国家,消费者希望吃到世界各地的新鲜产品,最好还能周年供应。然而鲜食产品的缺点在于多容易机械损伤,货架期短,统计表明鲜食产品的采后腐烂高达50%。本研究旨在尽可能减少采后损失率。多聚半乳糖醛酸酶是一种细胞壁水解酶,在分解果胶和纤维素中起关键作用。基于此,试验中测定了辣椒栽培品种曼迪和塔兰多的多聚半乳糖醛酸酶的活性及其表达情况,从两个辣椒品种果实三个不同成熟阶段文库中克隆得到多聚半乳糖醛酸酶基因(CaPG基因),将候选多聚半乳糖醛酸酶基因亚克隆入植物表达载体pVBG2307。通过超微结构观测两个试验材料,在不同的成熟期,多聚半乳糖醛酸酶活性和表达对细胞壁结构变化起了关键作用。根据形态学观察,多聚半乳糖醛酸酶活性(PG)测定,RT-PCR和超微结构试验分析多聚半乳糖醛酸酶从绿熟期、转色期到成熟期在果皮中的变化趋势。结果表明:CaPG基因表达,PG活性,转色期细胞壁结构在不同成熟阶段均有变化。供试材料的CaPG基因在成熟和完熟阶段变化明显,在转色期之前果实或组织中没有表达,CaPG基因调节果实成熟中起到关键作用:溶解中胶层,降解细胞壁。通过半定量检测,扫描电镜观察,充分显示不同成熟阶段PG活性显著变化。利用植物表达载体pCAMBIA2300,在多克隆位点处插入了35s启动子(片段源于质粒pBI121)和NOS终止子(片段源于质粒pBI221),构建了植物表达载体pVBG2307,载体具有完整的TDNA区。载体构建好后,在多克隆位点分别插入目的基因PG,orf456,ipt genes和E8(番茄果实特异启动子)之后,转化大肠杆菌菌株E. coli和农杆菌菌株EHA105-4,PCR检测表明植物表达载体构建成功。通过农杆菌介导的叶盘法转化方案,以茄科的辣椒自交系B-72,小番茄(Micro-Tom)和烟草(Bai Ri-Hong)为试材,目前已获得辣椒和烟草的转基因植株。


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