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复方人参皂甙纳米乳的制备及其免疫增强作用的研究

曹发昊  
【摘要】:目的:本研究通过纳米技术将人参皂甙(GS)和盐酸左旋咪唑(LH)组合成复方人参皂甙(GS-LH-NE),对其处方组成、质量性能、生物安全性以及免疫增强作用进行研究,旨在提高GS和LH稳定性的同时,开发一种复方免疫增强剂,减少LH用量,从而降低其毒副作用和药物残留。 方法:(1)样品用甲醇超声处理后,过树脂将GS和LH分离,建立GS-LH-NE药物含量检测方法。(2)利用伪三元相图考察不同纳米乳体系的形成情况,根据纳米乳区大小、纳米乳稳定性以及对药物的溶解能力,筛选出GS-LH-NE药用空白纳米乳配方;然后通过脾淋巴细胞增殖和单核巨噬细胞碳廓清试验,研究不同含药量纳米乳对免疫抑制小鼠的免疫增强作用,从中筛选出免疫增强作用较好的含药纳米乳作为GS-LH-NE处方,并对其进行质量评价。(3)通过家兔皮肤和肌肉刺激试验、小鼠急性毒性试验,考察GS-LH-NE生物安全性。(4)将免疫抑制小鼠分为:正常对照组、模型对照组、空白纳米乳组、LH-NE组、GS-NE组、GS-LH水溶液组、GS-LH-NE高、中、低剂量组,对其细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫的相关指标进行检测,研究GS-LH-NE中GS和LH合用的免疫增强效果。(5)将卵清白蛋白(OVA)免疫小鼠分为:正常对照组、OVA对照组、空白纳米乳组、LH-NE组、GS-NE组、GS-LH水溶液组、GS-LH-NE高、中、低剂量组,对其血清抗体及其亚类水平、脾淋巴细胞增殖活性、脾细胞因子产生、NK细胞活性进行检测,研究GS-LH-NE灌胃对抗原免疫的增强作用。(6)从脾淋巴细胞增殖、脾淋巴细胞因子产生以及腹腔巨噬细胞能量代谢、吞噬活性及其效应分子产生等方面,研究GS-LH-NE体外对小鼠主要免疫细胞的作用。 结果:(1)比色-分光光度法测GS含量:平均回收率及其RSD分别为98.86%和0.38%,重复性试验RSD为0.46%,日内和日间精密度RSD分别为0.73%和2.38%;高效液相色谱法测LH含量:平均回收率及其RSD分别为99.02%和0.40%,重复性试验峰面积和保留时间的RSD分别为0.34%和0.77%,日内和日间精密度RSD分别为1.01%和2.03%。(2)GS-LH-NE处方为Solutol HS-15/甘油/PEG400/肉豆蔻酸异丙酯/蒸馏水(质量比为25.33:10.14:2.53:6:56),GS和LH含量分别为30.15mg/mL和30.04mg/mL。它是黄色透明O/W纳米乳,液滴呈球形,平均粒径为23.08nm,粒度分散指数为0.237,浊点为75.4℃,pH为5.67;稳定性好,有效期为18个月。(3)GS-LH-NE一次性或多次用药对完整皮肤和破损皮肤均无刺激;GS-LH-NE对股四头肌刺激反应级最高与最低之差小于2,刺激反应总分为2;GS-LH-NE对小鼠灌胃半数致死量为402.85mg/kg。(4)GS-LH-NE对免疫抑制小鼠免疫增强作用的研究GS-LH-NE中剂量组脾脏指数和胸腺指数与模型对照组比较均显著升高;较LH-NE组分别显著增加56.71%和52.76%;较GS-NE组分别显著增加52.98%和56.70%;较GS-LH水溶液组分别显著增加21.23%和20.63%;与高、低剂量比较均显著升高。GS-LH-NE中剂量组迟发型超敏反应耳重差和ConA诱导脾淋巴细胞增殖的刺激指数与模型对照组比较均显著升高;较LH-NE组分别显著增加43.02%和44.27%;较GS-NE组分别显著增加46.88%和47.66%;较GS-LH水溶液组分别显著增加18.50%和18.13%;与高、低剂量组比较均显著升高。GS-LH-NE中剂量组LPS诱导脾淋巴细胞增殖的刺激指数、血清溶血素水平和抗体形成细胞水平与模型对照组比较均显著升高;较LH-NE组分别显著增加41.27%、64.39%和41.88%;较GS-NE组分别显著增加35.88%、51.81%和39.17%;较GS-LH水溶液组分别显著增加16.34%、24.01%和22.75%;与高、低剂量组比较均显著升高。GS-LH-NE中剂量组单核巨噬细胞吞噬指数、腹腔巨噬细胞吞噬率和吞噬指数、血清溶菌酶水平和脾NK细胞杀伤率与模型对照组比较均显著升高;较LH-NE组分别显著增加33.97%、43.32%、38.46%、39.12%和36.49%;较GS-NE组分别显著增加37.80%、47.22%、44.00%、44.85%和40.69%;较GS-LH水溶液组分别显著增加14.84%、20.87%、18.03%、16.79%和14.96%;与高、低剂量组比较均显著升高。(5)GS-LH-NE对OVA免疫小鼠免疫增强作用的研究GS-LH-NE中剂量组IgG、IgG1和IL-4水平与OVA对照组和低剂量组比较均显著升高;与GS-NE组、GS-LH水溶液组、高剂量组比较均有所升高,但差异均不显著;较LH-NE组分别显著增加31.09%、45.63%和67.62%。GS-LH-NE中剂量组IgG2a和IFN-γ水平与OVA对照组比较均显著升高;较LH-NE组分别显著增加32.75%和40.94%;较GS-NE组分别显著增加34.46%和49.59%;较GS-LH水溶液组分别显著增加11.27%和11.90%;与高、低剂量组比较均显著升高。GS-LH-NE中剂量组ConA、OVA诱导脾淋巴细胞增殖的刺激指数和脾NK细胞活性与OVA对照组均显著升高;较LH-NE组分别显著增加35.96%、39.07%和31.44%;较GS-NE组分别显著增加39.64%、35.48%和36.16%;较GS-LH水溶液组分别显著增加11.91%、15.38%和16.40%;与高、低剂量组比较均显著升高。GS-LH-NE中剂量组LPS诱导脾淋巴细胞增殖的刺激指数与OVA对照组和低剂量组比较显著升高;较LH-NE组显著增加30.41%;与GS-NE组、GS-LH水溶液组和高剂量组比较有所升高,但差异不显著。(6)GS-LH-NE体外对脾淋巴细胞的作用:GS-LH-NE在3.13~12.50μg/mL既能单独又能协同ConA或LPS显著促进脾淋巴细胞增殖,促进脾淋巴细胞产生IL-2和IFN-γ,并且GS-LH-NE在3.13和6.25μg/mL时对脾淋巴细胞免疫功能的增强作用显著强于GS-LH水溶液。GS-LH-NE体外对腹腔巨噬细胞的作用:GS-LH-NE在1.57~6.25μg/mL能显著提高巨噬细胞的能量代谢水平和吞噬活性,促进巨噬细胞产生NO和IL-1β,并且GS-LH-NE在1.57μg/mL时对巨噬细胞免疫功能的增强作用显著强于GS-LH水溶液。 结论:(1)GS和LH含量检测方法的回收率、重复性和精密度均能满足要求,为GS-LH-NE的制备及其质量评价提供了可靠的质检方法。(2)GS-LH-NE处方为Solutol HS-15/甘油/PEG400/肉豆蔻酸异丙酯/蒸馏水(质量比为25.33:10.14:2.53:6:56),GS和LH含量分别为30.15mg/mL和30.04mg/mL,是黄色透明的水包油纳米乳,平均粒径为23.08nm,有效期为18个月。(3)GS-LH-NE对皮肤和肌肉无刺激,对小鼠灌胃半数致死量为402.85mg/kg。(4)GS-LH-NE中GS和LH合用能协同增强免疫抑制小鼠的细胞免疫、体液免疫和非特异性免疫功能,并且其免疫增强作用显著强于GS-LH水溶液;其免疫增强作用和其剂量呈“钟罩”型量效关系。(5)GS-LH-NE灌胃能诱导OVA免疫小鼠产生Th1/Th2混合型免疫反应,增强其细胞免疫、体液免疫以及NK细胞活性;其免疫增强作用和剂量呈“钟罩”型量效关系。GS-LH-NE对细胞免疫和NK细胞活性的增强作用显著强于LH-NE、GS-NE和GS-LH水溶液;对体液免疫的增强作用显著强于LH-NE,较GS-NE和GS-LH水溶液有所增强,但无统计学意义。(6)GS-LH-NE在一定浓度范围内能增强淋巴细胞和巨噬细胞的免疫功能,并且其作用显著强于GS-LH水溶液。 GS-LH-NE是一种稳定、安全、有效的复方免疫增强剂,提高了药物的免疫增强效果,有助于减少LH用量,从而降低其毒副作用和药物残留,可用于增强免疫低下机体的免疫功能和抗原的免疫效果。


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