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猪骨骼肌生长发育相关基因和microRNA鉴定及其网络互作分析

赵拴平  
【摘要】:本研究以长白猪(瘦肉型)、通城猪(脂肪型)和五指山猪(小型猪)妊娠33天、65天和90天的胚胎骨骼肌作为研究对象,运用寡核苷酸基因芯片和microRNA芯片分析不同品种猪胚胎骨骼肌生长发育过程中的差异表达基因和差异表达miRNA,利用定量PCR技术对部分差异表达基因和miRNA进行验证,利用Cluster3.0软件对三个品种猪骨骼肌差异基因表达谱进行聚类分析;运用DAVID数据库对差异表达基因进行功能注释和通路分析;分析每个品种猪不同发育阶段差异基因的表达趋势,筛选差异表达基因群,根据其功能属性,构建基因间作用网络。依据差异基因与miRNA的表达相关性,构建miRNA-gene作用网络,并对网络中的基因进行功能注释,构建miRNA-GO网络。结合TargetScan和PicTar数据库,筛选部分骨骼肌生长发育相关miRNA和靶基因进行荧光素酶、定量PCR和western blot验证。此外,运用定量PCR技术对OLFML3基因和miR-155进行了组织表达谱分析,并分析其在长白猪和通城猪骨骼肌生长发育过程中(胚胎期12个时期和出生后10个时期)的表达变化。本研究主要结果如下: 1.在不同品种猪胚胎骨骼肌生长发育过程中,发现长白猪、通城猪和五指山猪中分别有1402、912和1910个差异表达基因。三个品种猪中有190个共同的差异表达基因,长白猪和通城猪中有233个共同的差异表达基因,长白猪和五指山猪中有230个共同的差异表达基因,通城猪和五指山猪中有83个共同的差异表达基因(p0.01, FDR0.05)。 2.在miRNA表达芯片中,长白猪、通城猪和五指山猪骨骼肌生长发育过程中分别有33、18和67个差异表达miRNA。三个品种猪中有9个共同的差异表达miRNA,长白猪和通城猪中有2个共同的差异表达miRNA,长白猪和五指山猪中有20个共同的差异表达miRNA,通城猪和五指山猪中有4个共同的差异表达miRNA (p0.05, FDR0.5)。 3.定量PCR验证结果显示12个差异表达基因和3个差异表达miRNA的表达趋势与芯片结果基本一致,相关系数分别为0.7511(p0.01)和0.7937(p0.01)。 4.差异表达基因聚类分析结果显示,长白猪和通城猪有相似的基因表达谱,聚为一类,五指山猪单独聚为一类。 5.差异表达基因GO和pathway分析结果显示,长白猪、通城猪和五指山猪中差异表达基因共同参与的生物学过程有有丝分裂细胞周期、核分裂、肌肉系统进程、单糖代谢过程、前体代谢产物和能量产生、肌收缩、细胞骨架形成、肌器官发育、己醣代谢、细胞周期等。长白猪和通城猪中差异表达基因共同参与的信号通路有肌收缩、帕金森综合症、氧化磷酸化、病毒性心肌炎、I型糖尿病、扩张性心肌病等;长白猪和五指山猪中差异表达基因共同参与的信号通路有细胞周期;通城猪和五指山猪中差异表达基因共同参与的信号通路有谷胱甘肽代谢。 6.差异基因表达趋势分析结果显示,长白猪中趋势15、通城猪中趋势15和五指山猪中趋势11的整体基因表达水平明显上调,长白猪中趋势0、通城猪中趋势3和五指山猪中趋势4的整体基因表达水平出现明显下调。差异基因间作用网络显示在长白猪、通城猪和五指山猪中,一个基因的表达通常受到多个基因的共同调节,同时参与多个基因的作用。 7. miRNA-gene互作网络显示:长白猪中28个差异表达miRNA调节290个差异基因的表达;通城猪中15个差异表达miRNA调节91个差异基因的表达;五指山猪中57个差异表达miRNA调节502个差异基因的表达。靶基因功能分析结果显示,长白猪和通城猪中差异miRNA调控的靶基因涉及15个显著性功能分类;五指山猪中靶基因涉及19个显著性功能分类。 8. TargetScan和PicTar数据库预测结果显示,OLFML3基因受miR-155调控,CNN3基因受miR-200c、miR-7、miR-1、miR-206、miR-124和miR-153等调控,RAP2C基因受miR-19ab、miR-130ab和miR-133ab等调控,MAP1A基因受miR-1、miR-206、miR-613、miR-9、miR-181abc、miR-26ab和miR-34ac等调控,SMARCD1基因受miR-21、miR-150、miR-122和miR-133b等调控,SFRS3基因受miR-21、miR-1和miR-206等调控。 9. miRNA靶基因验证结果显示,miR-206调节CNN3、MAP1A和SFRS3基因的表达,miR-133b调节RAP2C和SMARCD1基因的表达;miR-155在mRNA水平调节OLFML3基因的表达,miR-1a主要在翻译水平调节CNN3基因的表达。 10.定量PCR结果显示,OLFML3基因在肝脏和胰腺中表达量较高,在肺、小肠和胎盘中中度表达,在其他组织中的表达量较低;miR-155在小肠和肺中表达量较高,在心脏和胎盘中度表达,而在其他组织中表达较低。此外,OLFML3基因和miR-155在长白猪和通城猪胚胎骨骼肌生长发育过程中分别呈现不同的表达模式,可能与不同品种猪胚胎骨骼肌生长发育差异相关。


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