中国野生华东葡萄抗白粉病芪合成酶基因体外表达分析

【摘要】：葡萄白粉病是一种严重危害世界广泛栽培的欧洲葡萄（Vitis vinifera L.）品种的真菌病害。中国华东野生葡萄株系白河-35-1作为高抗白粉病的野生葡萄资源已被多次报道，催化白藜芦醇（Res）合成的芪合成酶基因在华东葡萄株系白河-35-1有较高的表达。本研究主要目的就是克隆华东葡萄株系白河-35-1抗白粉病芪合成酶基因VpSTS和欧洲感病品种佳利酿、无核白葡萄白粉病诱导表达的芪合成酶基因VvcSTS，VvtSTS，构建其酿酒酵母和大肠杆菌体外生物合成Res体系，进行体外表达比较，为葡萄抗病功能基因库的构建提供实验证据。本研究还克隆了玉米、烟草香豆酸CoA连接酶基因M4CL，T4CL，作为STS基因体外生物合成Res的上游基因，比较其体外表达活性和表达差异。主要研究内容如下： 1、克隆了白粉病菌诱导表达的中国野生华东葡萄株系白河-35-1、佳利酿和无核白葡萄芪合成酶基因VpSTS、VvcSTS、VvtSTS-1，无核白葡萄胚珠败育库液芪合成酶基因VvtSTS-2，已登陆Genbank数据库，登录号分别为：VvcSTS为HQ399460，VvtSTS-1是HQ399461，VvtSTS-2是HQ399462。这3个基因编码框均为1179bp，共编码392个氨基酸，与VpSTS6（中国华东野生葡萄株系白河-35-1，GenBank登录号为DQ445490）基因序列同源性分别为97.94%、97.69%、96.66%。 2、构建了17株目的基因表达工程菌： ①pYES6/CT-VpSTS酿酒酵母表达菌1株； ②pYES2-VpSTS、pYES2-VvcSTS、pYES2-VvtSTS1、pYES2-VvtSTS2、pYES2-T4CL酿酒酵母胞内表达菌5株；pYES2-α-VpSTS、pYES2-α-VvcSTS、pYES2-α-VvtSTS、pYES2-I-VpSTS、pYES2-I-VvcSTS、pYES2-I-VvtSTS酿酒酵母分泌型表达菌6株。 ③pET32a-VpSTS、pET32a-VvtSTS、pET32a-VvcSTS和pET32a-T4CL、pET32a-M4CL的大肠杆菌表达菌5株。 3、对17株表达菌分别进行了体外表达分析 ①pYES6/CT-VpSTS重组酵母菌的诱导表达分析结果显示：pYES6/CT-VpSTS重组酵母菌有很好的遗传稳定性，经诱导检测到64KDa的融合表达产物，在诱导处理48h、60h和72h均可稳定表达。培养液和菌体中Res的高压液相（HPLC）检测结果显示，VpSTS基因的导入和表达，可提高宿主菌中Res的含量，并且随着诱导处理时间的延续，菌液中Res的含量有明显提高，诱导处理36h时达最高（0.765mg/L）。 ②对3株酵母胞内表达工程菌诱导处理72h，电泳结果发现有52.5kDa的目的表达产物出现；诱导处理36h、48h，表达产物丰度最高，而且VpSTS的表达产物最高，VvcSTS次之，VvtSTS最弱；基因VvtSTS-2和VvtSTS-1表达产物丰度没有差异。 对基因STS的pYES2-α和pYES2-INU分泌型酵母表达菌诱导处理分析结果显示：诱导72h，分泌产物累积量最多。对于pYES2-α分泌型，三个STS基因，VpSTS的水平最高、VvcSTS次之，VvtSTS未检测到；对于pYES2-I分泌型表达菌，VpSTS水平最高，VvtSTS次之、VvcSTS最弱。 ③辅助表达质粒pRARE2在大肠杆菌pET32a表达系统中有助于基因VpSTS、VvtSTS、VvcSTS、M4CL和T4CL的表达。 4、构建了基因STS表达产物Res体外复合生物合成体系： 按STS+T4CL组成基因STS大肠杆菌和酵母菌复合生物合成体系，添加底物，进行共诱导表达生物合成。HPLC检测菌液中Res的量表明：基因VpSTS、VvtSTS酵母组合体系中Res的含量分别为1.09mg/L菌液（12.0g湿菌体/L菌液）、0.96mg/L菌液（12.9g湿菌体/L菌液），显著高于酵母本底Res水平（75g湿菌体/L菌液，0.011mg/L菌液），构建的VvcSTS基因的组合体系中Res水平没有变化。在大肠杆菌pET32a-4CL+pET32a-STS合成体系中，在VpSTS、VvtSTS组合体系中检测到Res，含量分别为1.75mg/L菌液（51g湿菌体/L菌液）、1.62mg/L菌液（51.4g湿菌体/L菌液）。构建的基因T4CL+STS的酶促合成体系中，只有VpSTS、VvtSTS基因有Res的产生，含量分别为1.15mg/L和1.17mg/L，VvcSTS没有Res的产生。本研究表明，中国野生华东葡萄白河-35-1抗白粉病芪合成酶基因可以在体外表达产生Res，而欧洲葡萄佳利酿未检测出表达的Res产物。这说明中国野生华东葡萄白河-35-1抗白粉病芪合成酶基因VpSTS与欧洲品种葡萄佳利酿的芪合成酶基因VvcSTS在体外的表达存在着功能的差异。