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稀有鮈鲫ER基因的克隆及内分泌干扰物对其表达的影响

王厚鹏  
【摘要】:内分泌干扰物(Endocrine disrupting chemicals, EDCs)具有类激素的作用,能够干扰生物包括人类在内的正常的内分泌功能,环境雌激素是其中重要的一员。雌激素在脊椎动物的许多生理过程中起着重要的作用,机体中介导雌激素发挥雌激素效应主要是通过雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)完成的,雌激素与ER结合形成雌激素-ER复合体,引起雌激素受体构象发生改变,通过与靶基因上游调控区域的雌激素反应元件(estrogen response element,ERE)结合,增强并调控靶基因的转录,进而影响靶基因编码蛋白的水平,调节机体的生长、发育及生殖活动。在鱼类中,ER大多包含三种类型,分别为ERα、ERβ1和ERβ2,参与鱼类的性别决定和性别分化等生理过程。稀有鮈鲫是我国特有的一种小型的鲤科鱼类,被广泛用于水生毒理学的研究,是一种理想的研究EDCs的模式鱼类。 为研究EDCs对稀有鮈鲫雌激素受体基因mRNA的干扰作用,并探究EDCs在体内的作用机制,本实验通过同源克隆和RACE的方法获得了稀有鮈鲫雌激素受体基因ERα、ERβ1和ERβ2三个基因的全长cDNA序列,长度分别为2438bp、2724bp和2600bp,共编码氨基酸残基分别为598、608和554个。序列分析发现,稀有鮈鲫ERα、ERβ1和ERβ2基因结构同其他的核受体家族一样,也是分为六个功能结构域,从N端到C端依次为A/B,C,D,E和F,其中C区和E区高度保守,分别为DNA结合区和配体结合区。多重序列比对及系统发育树分析表明,获得的稀有鮈鲫ER基因编码的氨基酸与其他鲤科鱼类的氨基酸具有较高的相似性,ERα与黑头软口鲦的ERα相似性为91.1%,ERβ1与拟鲤的ERβ1相似性为92.9%,ERβ2与唐鱼的ERβ2相似性为93.5%。半定量RT-PCR的方法检测ERα、ERβ1和ERβ2基因的组织分布情况,结果显示ERα基因mRNA主要在性腺和肝脏中表达;ERβ1在雌鱼中,肝脏的表达量最高,在雄鱼中,主要在肠、睾丸及肝脏中表达;ERβ2在肠、肝脏及性腺中具有较高的表达量。 用受精后34天的稀有鮈鲫幼鱼进行EDCs(EE2,NP和BPA)暴露试验,每种EDCs设三个暴露浓度:EE2(0.01,0.1,1nM)、NP(10,100,1000nM)、BPA(0.1,1,10nM),暴露3天后,实时定量PCR的方法检测ERα、ERβ1和ERβ2基因mRNA的变化。同对照相比结果显示,三个浓度的EE2能够极显著的升高ERα基因mRNA的表达,但又均抑制ERβ1基因mRNA的并在1nM时抑制作用达到极显著的水平,对ERβ2基因mRNA的表达变化在高低浓度之间表现出相反的结果,0.1nM的EE2显著升高ERβ2基因mRNA的表达而1nM的EE2显著降低ERβ2基因mRNA的表达;除了10nM的NP对ERα基因mRNA的表达略有升高外,三个浓度的NP对ERα、ERβ1和ERβ2基因mRNA的表达均表现出不同程度的抑制作用;BPA作为一种具有弱雌激素效应的EDCs,对稀有鮈鲫ERα、ERβ1和ERβ2基因mNRA的表达影响不是很明显,只在10nM和1nM的BPA浓度下分别对ERα的升高和ERβ2的降低达到了显著的水平,其他浓度均无明显的影响。 结果表明,EDCs(EE2、NP、BPA)对不同类型的雌激素受体基因mRNA影响并不是以相同的方式产生作用的;不同类型的雌激素受体基因也可能参与到其他的调控方式共同调节鱼类的生长、发育和繁殖。


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