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棉铃虫羧酸酯酶表达及解毒作用研究

李永强  
【摘要】:羧酸酯酶是昆虫对有机磷、拟除虫菊酯、氨基甲酸酯等杀虫剂进行解毒作用的重要代谢酶系。为研究羧酸酯酶在棉铃虫有机磷、拟除虫菊酯代谢抗性中的作用和角色以及解毒酶在环境修复中的应用,本文采用杆状病毒表达载体系统(BEVS)对澳洲棉铃虫GR品系的9个羧酸酯酶基因进行了异源真核表达,从分子和生化水平上研究了其对有机磷、拟除虫菊酯类杀虫剂的酶促解毒特性;并利用氨基酸定点突变技术人工构建了1~2个位点突变的18个羧酸酯酶突变体,研究了突变对有机磷及拟除虫菊酯类杀虫剂的解毒活性的影响;在此基础上初步构建了解毒酶工程菌,旨在为环境污染修复奠定基础。主要研究结果如下: 1.棉铃虫羧酸酯酶在昆虫杆状病毒表达载体系统中的表达及酶活分析 从棉铃虫GR品系的cDNA文库中得到9个羧酸酯酶基因,氨基酸序列比对表明其均具有酯酶活性必须的催化三联体残基(S-E-H),以及酯酶家族的特征基序(G-x-S-x-G)和酶活相关的氧阴离子洞氨基酸残基(G-G-A),表明均为有酶促活性的酯酶基因。酯酶与杆状病毒线型DNA重组后,转染草地夜蛾Sf9细胞系,表达和制备了具有天然酶活性的酯酶蛋白产物。Native-PAGE和α-乙酸萘酯检测表明,酯酶条带主要分布在相对迁移率(Rm值)为0.27~0.35和0.39~0.48之间的两个区域,很可能是与棉铃虫代谢抗性相关酯酶。紫外读板机测定结果进一步表明,酯酶对α-乙酸萘酯底物的亲和系数(Km值)在3.3μmol/L~671μmol/L之间,速率常数(kcat/Km值)在0.3μmol~(-1)·S-1·L~95μmol~(-1)·S~(-1)·L之间。酯酶对α-乙酸萘酯的酶促水解活性普遍高于4-硝基苯基乙酸酯。 2.棉铃虫羧酸酯酶对有机磷的解毒活性 采用荧光法根据酯酶与2种有机磷底物的酶促反应特点,测定了表达产物中的酯酶浓度及解毒活性,结果表明8个酯酶对二甲基和二乙基有机磷(dMUP和dECP)均有一定代谢活性,催化反应常数(kcat值)在1.5×10-3min~(-1)~15.8×10-3min~(-1)之间,与对照铜绿蝇酯酶E3(kcat=3.5×10-3min~(-1))的代谢活性处在同一水平范围。棉铃虫酯酶对模式羧酸酯底物的水解活性与其对有机磷杀虫剂的解毒活性无直接相关性。 3.棉铃虫羧酸酯酶对氰戊菊酯和氯氰菊酯异构体的解毒活性 通过荧光仪和高效液相色谱(HPLC)仪测定了其对氰戊菊酯(类型I)1种异构体2(S)-α(S)及4种异构体类似物的解毒活性,结果表明4个酯酶(001B、001C、001D、001J)对异构体2(R)-α(R)和2(R)-α(S)类似物的酶促解毒活性较高;其中酯酶001G对顺式氰戊菊酯杀虫剂异构体2(S)-α(S)的解毒活性为13.19μmol·min~(-1)·μmol~(-1),其余酯酶解毒活性均较低。酯酶对氯氰菊酯8种异构体(类型II)及异构体类似物的测定结果表明,其中4个酯酶(001B、001C、001D和001J)对氯氰菊酯的2种反式异构体1(S) trans及类似物的解毒活性最高(17μmol·min~(-1)·μmol~(-1)~43μmol·min~(-1)·μmol~(-1)),但对杀虫毒性最高的异构体1(R)cis-α(S)及其类似物的解毒活性却相对很低;另外4个酯酶对氯氰菊酯异构体及类似物代谢作用极弱甚至难以检测到。 4.棉铃虫羧酸酯酶突变体的构建及对模式羧酸酯的酶促动力学特性 基于氨基酸序列比对和分析,采用定点突变技术构建了在棉铃虫酯酶氧阴离子洞和酰基化口袋内1~2个氨基酸位点突变的18个酯酶突变体。酶促动力学分析表明,酯酶氧阴离子洞丙氨酸(或甘氨酸)变为天冬氨酸(A/G→D)的突变体对α-乙酸萘酯的亲和力普遍降低(Km值升高),速率常数(kcat/Km值)也降低至突变前的1/20~1/437;酰基化口袋的苯丙氨酸变为亮氨酸的突变(F→L)同样降低了酯酶对羧酸酯底物的亲和力和水解活性,但与氧阴离子洞突变相比对酶的水解活性影响相对较小,速率常数最低降至突变前的1/5;酯酶在上述两个位点同时突变的双位点突变体(A/G→D+F→L)则几乎完全失去了对底物的酶促水解活性。上述酯酶突变也显著降低了酯酶对另一种模式羧酸酯底物4-硝基苯基乙酸酯的酶促水解活性。 5.羧酸酯酶突变对有机磷的解毒活性影响 酯酶单双位点的突变对有机磷的解毒活性也产生了较大的影响,部分突变体提高了对有机磷的解毒活性,相反部分突变体则降低了解毒活性。氧阴离子洞突变的部分突变体增强了对有机磷底物的解毒作用,尤其是001CA127D对二乙基有机磷dECP的kcat值高达32.8×10-3min~(-1),是突变前的7倍。酯酶酰基化口袋突变的5个突变体,对分子结构较小的二甲基有机磷dMUP的kcat值均提高到突变前的2倍以上,解毒活性均高于分子结构较大的二乙基有机磷dECP,表现出对dMUP的代谢偏爱性。双位点突变中多数酯酶对2种有机磷底物的代谢活性有增强作用。 6.羧酸酯酶突变对拟除虫菊酯异构体解毒活性影响 通过荧光仪对类型I和类型II拟除虫菊酯异构体解毒作用测定结果表明,棉铃虫酯酶氧阴离子洞和酰基化口袋突变体中,仅有001BF236L、001DF235L和001GF238L对氰戊菊酯4个异构体类似物有代谢活性,与突变前相比是降低的。采用HPLC测定结果表明,只有001BF236L对氰戊菊酯2(S)-α(S)异构体解毒活性提高到突变前的4倍,其它突变体的解毒活性均很低,与突变前相比明显降低。 5个氧阴离子洞突变体酯酶对氯氰菊酯的8种异构体的解毒活性均极低,这与未检测到其对类似物的代谢活性是一致的。5个酯酶酰基化口袋突变体中001BF236L、001DF235L和001JF236L对2种反式氯氰菊酯异构体1(S)trans的解毒活性与突变前相比几乎都是增强的。特别是001DF235L和001JF236L对1(S)trans-α(R)的解毒活性分别为43μmol·min~(-1)·μmol~(-1)和51μmol·min~(-1)·μmol~(-1),接近突变前的2倍。其中001DF235L对杀虫毒性较强的顺式异构体1(R)cis-α(S)的解毒活性也较高,为15.6μmol·min~(-1)·μmol~(-1)。三个双位点突变体中,均未检测到对氯氰菊酯的8种异构体类似物的代谢活性,但却检测到个别酯酶对部分异构体有较低的代谢作用。 7.羧酸酯酶解毒酶工程菌构建和表达 采用原核生物表达系统,将去掉N端信号肽的001C、001C~(A127D)、001F和001F~(A127D+F238L),以及001I和001I~(G130D)与PETMCS III载体重组,转入大肠杆菌(Ecoli.BL21)菌株中,构建解毒酶工程菌。在温度为18℃、28℃和37℃条件下分别表达后,SDS凝胶电泳检测结果表明在温度为37℃时酯酶表达量最大;但酯酶表达产物主要以无活性的非水溶性形式存在,水溶性酯酶(有活性)占的比例非常低。提高活性酯酶表达量及解毒活性等相关工作尚需继续深入,但目前的工作为进一步的解毒酶工程菌研究奠定了前期基础。 综上所述,文中通过对来源于澳洲棉铃虫敏感品系(GR)的9个羧酸酯酶基因进行氨基酸序列分析和异源真核表达产物的代谢活性检测,从分子水平和生化水平两方面证实其中8个羧酸酯酶分别对2种有机磷和2种拟除虫菊酯类杀虫剂具有一定代谢解毒活性。通过人工定点突变和代谢活性检测,表明氧阴离子洞和酰基化口袋位点突变对酯酶的活性有明显影响,部分酯酶增强了对二甲基和二乙基有机磷、类型II拟除虫菊酯的解毒活性。去掉N端信号肽的部分酯酶在大肠杆菌中表达后,具天然酶活的酯酶表达水平较低,这为进一步构建高效解毒酶工程菌奠定了一定前期基础。上述结果,预示着羧酸酯酶突变在今后棉铃虫对有机磷和拟除虫菊酯类杀虫剂的代谢抗性发展中可能起着重要作用;同时也表明通过人工突变修饰可以提高棉铃虫羧酸酯酶的解毒活性。


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