基于高通量测序技术的小麦和紫茎泽兰基因组学初步研究

【摘要】：基因组是一个物种的所有遗传信息的总和。基因组学就是在基因组水平上研究一个物种的序列结构、基因功能、表达调控网络以及代谢途径，是研究生命现象本质的科学。由于基因组庞大和结构复杂，植物基因组学研究一直是基因组学研究的难点和挑战。新一代高通量测序技术的产生和发展为非模式植物基因组学研究带来了新的机遇和契机。本研究采用Illumina\Solexa测序技术，以两种的非模式植物小麦和紫茎泽兰为研究对象，对小麦的单条染色体臂(7DL)进行的探查测序，对紫茎泽兰的核基因组、叶转录组和叶绿体基因组进行了测序及序列分析，以期获得大量的序列信息，揭示它们的基因组结构和遗传特征，建立其基因组学研究的平台。主要研究结果如下: (1)小麦7D染色体长臂(7DL)的探查(Survey)测序与序列分析。 首先，利用细胞流式仪分离小麦品种中国春7DL染色体的染色体DNA，然后利用Illumina Hiseq2000测序平台进行高通量测序，共产生了14.54Gb的数据，大约覆盖整个染色体臂40倍，利用短序列拼接软件Velvet进行De novo拼装，获得了160,021条大于200bp的contigs，总长达223Mb，覆盖了整个染色体臂65%；然后，对7DL上的功能基因进行了初步预测，共预测鉴定了各类重要的功能基因2,893个，其中2,573个能够被GO注释，这为7DL重要功能基因的克隆与功能研究提供重要的资源；进一步，采用生物信息学方法预测了编码20个miRNA家族的149个miRNA前体，并利用荧光定量PCR对随机挑选的5个miRNA在小麦不同组织中的表达量进行了分析，初步验证了预测结果的可靠性；最后，对拼接序列中的重复元件进行分析，预测了120,262转座子重复元件和16,325个微卫星重复元件，重复序列比例达84.8%，随机挑选了33个位点开发SSR标记并在20个小麦品种进行多态性验证，最终发现90%的引物能扩增，多态性标记达80%，利用缺体-四体检验发现18个标记是小麦7D所特异的，这为染色体特异分子标记的开发提供了一条新的思路。 (2)原生地和入侵地紫茎泽兰叶转录组的de novo测序与比较分析。 本研究利用Illumina GAIIx测序平台对原生地和入侵地紫茎泽兰的叶转录组进行了de novo测序，各测序了4G的数据量，混合所有数据进行序列拼装，共获得了127,189unigenes,这是作为紫茎泽兰平均基因长度为702bp;通过与nr等数据库比对，有53,886个Unigene能够被注释，占总Unigene数的42.37%；GO注释可以将41,481个Unigene注释到3大类65亚类的GO分类上，COG分析可以将17,498个Unigene注释到25种COG功能类型,主要功能包括细胞信号转导、次生物质生物合成、细胞代谢等；KEGG分析能把18,306个基因定位到297个代谢通路中，包括信号转导、物质代谢和次生代谢产物生物合成等。根据转录本表达丰度分析(RPKM值)，共筛选出9,495条差异表达的基因(︱log2Ratio︱≥1且FDR≤0.001)，这些基因可能与紫茎泽兰的入侵和适应进化相关，GO富集和KEGG富集分析发现他们的功能主要集中在次生代谢物生物合成和植物信号转导。 (3)紫茎泽兰叶绿体基因组的测序与菊科叶绿体的比较基因组学分析。 利用Illumina GAII测序平台对紫茎泽兰的叶绿体全基因组进行了测序。拼接获得了全长150,698bp的完整紫茎泽兰叶绿体基因组,这是第一个被测序的菊科泽兰属叶绿体基因组。它具有典型的真核生物叶绿体基因组结构，由一个长度为84,815bp的长单拷贝区（LSC），一个18,358bp的短单拷贝区（SSC）和一对长度为23,755bp的反向重复序列组成，共编码130个基因，其中蛋白编码基因86个，31个tRNA基因和4个rRNA基因，17个基因含有内含子。对紫茎泽兰叶绿体基因组中的重复元件进行预测，共鉴定出了31个串联重复元件和28离散重复元件,为叶绿体分子标记开发提供了重要资源。同时，利用本次测序的紫茎泽兰叶绿体基因组和公共数据库检索中收录的5个其他菊科叶绿体，在全基因组水平对菊科叶绿体的基因组成、序列差异和基因组结构等进行了比较基因组学分析，鉴定了5个(ndhD-ccsA, psbI-trnS, ndhF-ycf1, ndhI-ndhG和atpA-trnR)潜在的可用于菊科分子鉴定的叶绿体位点。最后，取33个叶绿体基因组中的35个基因组成序列矩阵，进行分子进化分析，发现紫茎泽兰与油菊的亲缘关系较近。 (4)紫茎泽兰部分核基因组微卫星序列特征分析与SSR分子标记开发。 利用高通量测序技术对紫茎泽兰总DNA进行了2倍覆盖度的探查测序，拼接获得了58,432个大于200bp的序列片段。利用这些序列对紫茎泽兰基因组微卫星序列的特征进行了分析，共鉴定到3,012个SSR位点，其中两碱基的重复是最丰富的重复类型；利用鉴定的SSR位点，开发了30个紫茎泽兰特异的SSR分子标记，并在24个材料中对标记的多态性进行了验证，结果发现，15对引物表现出多态性，等位位点数在2-5个，平均每个位点3个，遗传多样性指数(PIC)范围为0.08-0.59，平均值为0.30，期望杂合度(He)的范围为0.08-0.63，平均值为0.37；观测杂合度(Ho)的范围为0到1，平均值为0.44。本研究首次报道了紫茎泽兰的SSR分子标记，这些多态性标记将为紫茎泽兰的群体遗传学和分子生态学研究提供重要工具。