猕猴桃AsA合成相关酶基因及启动子的克隆与功能分析

【摘要】：抗坏血酸（AsA）是动植物体内重要的氧化还原剂，参与体内活性氧清除，调控细胞分裂和细胞生长，并作为多个酶的辅因子参与多种生理过程。此外，AsA为人类必需的营养物质，能增强人体相关免疫系统的活性，在由氧胁迫引起的相关疾病的防御方面，发挥着相当重要的作用。AsA还是植物生长调控的必需因子，它能控制植物的开花时间，还能够增强植物体对逆境的抵御能力，比如臭氧毒害、水涝胁迫、高温伤害和病原菌入侵等。 目前，推测AsA合成与积累的关键调控酶：包括GDP-D-甘露糖3’,5’-差向异构酶（GME）、L半乳糖-1-磷酸磷酸酶（GPP）和GDP-L-半乳糖磷酸化酶（GGP）。本研究以山梨猕猴桃（Actinidia rufa）、美味猕猴桃品种“秦美”（A. deliciosa cv.‘qinmei’）和毛花猕猴桃（A. eriantha）为材料，克隆了AsA合成相关酶基因GME、GPP和GGP，并利用实时荧光定量PCR分别分析了这些基因在不同处理条件下的表达模式；克隆了GME、GPP和GGP基因启动子序列并在不同处理下对其进行了活性分析；同时测定了不同处理条件下猕猴桃叶片中AsA含量变化。此外，还研究了猕猴桃果实发育期GGP基因表达水平的变化及其与AsA含量的关系。获得的主要结果如下： 1.从山梨猕猴桃和美味猕猴桃中克隆了GME基因全长，包含1143bp，编码376个氨基酸，把这两个cDNA分别命名为ArGME和AdGME，并登录Genebank，登陆号分别为JN132110和GU339037，二者序列相似性为99.7%。RT-qRCR结果表明：ABA、黑暗和光照处理对ArGME和AdGME基因在叶片中的表达量没有明显影响；GA3处理降低了ArGME和AdGME的表达；SA处理、机械损伤、高温和低温处理，均不同程度的增加了ArGME和AdGME的表达。相同处理对两个猕猴桃种的作用趋势基本一致。 2.利用染色体步移法克隆了山梨猕猴桃和美味猕猴桃GME基因启动子的序列，其长度均为1225-bp，命名为ParGME和PadGME，并登录Genebank，登陆号分别为JQ693500和JQ693499，二者序列相似性为99.16%。瞬时表达实验证明，这两个启动子具有转录活性。光照、机械损伤对GME基因的启动子没有明显的响应，而水杨酸和高温对GME基因启动子的活性却有很强的诱导和激活作用。 3.从美味猕猴桃中克隆了GPP基因并对其表达模式进行了分析，结果发现：持续的黑暗处理降低了GPP基因的表达，紧随其后的光照处理诱导了GPP基因的表达；SA对GPP基因的表达影响甚微；ABA、机械损伤和低氧胁迫能先增加GPP基因的表达而后降低其表达。 4.利用染色体步移法克隆美味猕猴桃GPP基因启动子，长度为1395-bp，瞬时表达实验证明，其具有转录活性。GPP基因启动子5’端缺失体实验表明，光照能够明显诱导GPP基因启动子的活性，重要的光调控元件可能位于-1210到-1047这个区段内。另外，ABA、SA、机械损伤和淹水等处理也能诱导GPP基因启动子的活性。 5.从山梨猕猴桃和毛花猕猴桃中克隆了GGP基因全长cDNA序列，命名为AeGGP(登录号：KC146049)和ArGGP(登录号：KC146048)。猕猴桃果实发育过程中，GGP基因表达与AsA含量变化一致，且毛花猕猴桃最高，山梨猕猴桃最低。GGP基因的表达对光很敏感；MeJA、高温和低氧能诱导GGP基因的表达，ABA降低了其表达。 6.利用染色体步移法克隆了山梨猕猴桃、美味猕猴桃和毛花猕猴桃GGP基因启动子的序列，山梨猕猴桃GGP基因启动子的活性最低，在其序列中发现了一段300bp的插入，启动子缺失体实验研究表明，在山梨猕猴桃GGP基因的启动子中可能存在负调控元件。光、ABA、MeJA、高温和低氧均能诱导GGP基因启动子的活性。根据毛花猕猴桃和美味猕猴桃GGP基因启动子缺失体对不同处理的响应情况，推测G-box motif可能在光暗响应中发挥着极为重要的作用；ABRE在ABA对GGP基因启动子的诱导中发挥了重要作用；CGTCA-motif元件在MeJA对GGP基因启动子的诱导中发挥了重要作用。