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MicroRNA-199a-5p对猪前体脂肪细胞增殖分化的调控作用研究

李岳峰  
【摘要】:MiR-199a-5p的表达量在肥胖个体的脂肪组织中上调,而在3T3-L1分化前期迅速下调,推测miR-199a-5p影响前体脂肪细胞(preadipocytes)的分化过程。在人类骨髓间充质干细胞(MSCs)成脂过程中的研究表明,超表达miR-199a-5p会导致成脂标志基因aP2的明显下调,但相关的研究还不够深入。MiR-199a-5p在成脂过程中的作用需进一步验证,其在脂肪细胞中的靶基因也还不明确。本研究使用了一种研究成脂过程常用的实验动物——猪,首先在体外建立了猪preadipocytes成脂分化模型。随后,本研究探讨了miR-199a-5p在猪preadipocytes增殖分化中的作用,并寻找其发挥作用所依赖的靶基因。这为进一步研究miR-199a-5p及其靶基因在成脂中的作用,以及畜牧生产中的育种工作提供了一定的理论依据。本研究获得了以下主要实验结果: 1. MiR-199a-5p在猪皮下白色脂肪组织中高表达且在猪preadipocytes分化初期表达量迅速下降。 本研究采用real-time qPCR技术,检测了miR-199a-5p在不同组织中的表达情况,发现miR-199a-5p高表达于猪皮下白色脂肪组织,推测其在成脂中具有一定的作用。同时,构建了猪preadipocytes体外分化模型,通过real-time qPCR技术检测发现,miR-199a-5p在猪preadipocytes分化初期表达量迅速下降,后期又上升。 2.超表达miR-199a-5p抑制猪preadipocytes的分化,促进其增殖。 超表达miR-199a-5p并诱导猪preadipocytes成脂分化,使用real-time qPCR和Western Blot技术检测发现,miR-199a-5p超表达抑制了成脂标志基因的表达。油红O染色和提取实验发现miR-199a-5p可以抑制分化过程中猪脂肪细胞脂质的积累。在猪preadipocytes增殖阶段超表达miR-199a-5p,利用流式细胞术检测细胞周期,并通过核染检测miR-199a-5p超表达对细胞数量的影响。结果显示,miR-199a-5p能够促进猪preadipocytes的增殖。 3. MiR-199a-5p在猪脂肪细胞中可以靶定Cav-1 利用在线软件预测miR-199a-5p的靶基因,并结合文献分析,发现在预测到的靶基因中,Cav-1已被证明对脂肪细胞的分化具有促进作用,可以作为miR-199a-5p的候选靶基因。利用real-time qPCR、Western Blot技术和荧光素酶报告基因验证了miR-199a-5p可以在猪脂肪细胞中靶定Cav-1。综合上述实验结果,推测miR-199a-5p对脂肪细胞的作用一定程度上是通过靶定Cav-1实现的。


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