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FABP4对3T3-L1脂肪细胞中脂肪酸代谢和线粒体功能的影响

谈笑  
【摘要】:脂肪酸结合蛋白4(FABP4)是脂肪酸结合蛋白家族的一员,作为膜周边蛋白,FABP4能够结合多种疏水性化合物,例如长链脂肪酸、多种环氧化酶和脂肪氧化产物,同时参与其代谢和信号转导过程,并在糖尿病、肥胖和脂代谢紊乱等疾病的形成中发挥着关键作用。线粒体脂肪酸氧化(FAO)涉及能量代谢过程中多个部位的调控,其中任何一个代谢途径发生异常均会引起FAO障碍,导致机体能量供给不足。本研究旨在探讨FABP4对脂肪细胞中脂肪酸代谢和线粒体功能的调节作用及对相关信号通路的影响。这些结果将为系统研究动物体内脂肪降解过程中线粒体的调控作用和机制提供一定的理论依据。 为了探究FABP4对脂肪酸代谢和线粒体功能的作用,本实验首先构建了FABP4真核表达载体,并采用RNA沉默技术筛选获得了FABP4干扰载体。通过转染3T3-L1前脂肪细胞并诱导分化,利用实时定量PCR,蛋白免疫印迹,酶联免疫法,流式细胞术等实验技术检测了FABP4对3T3-L1细胞脂肪酸代谢和转运关键因子表达,相关信号通路因子表达以及对线粒体功能的影响,初步探讨了FABP4对3T3-L1细胞中脂肪酸代谢和转运以及线粒体功能的作用。获得以下结论: 1.以小鼠脂肪组织提取的RNA为模板,通过PCR方法克隆得到包含CDS区的FABP4基因,构建pcDNA3.1-Fabp4重组质粒,酶切和测序鉴定均证明pcDNA3.1-Fabp4重组真核表达载体构建成功。 2.利用脂质体法转染FABP4超表达载体和干扰载体,RT-PCR和Western blotting检测FABP4mRNA和蛋白的表达,结果显示pcDNA3.1-Fabp4转染组中FABP4mRNA和蛋白水平均显著升高(P0.01);四个干扰载体组中FABP4mRNA和蛋白表达水平均显著低于对照组(P0.01),且组4的表达量为最低。 3.超表达FABP4正调控3T3-L1脂肪细胞分化和脂质沉积,显著促进PPARγ、CEBPα、FAS、ACC、FATP1的表达和培养基中甘油与FFA的释放,增强脂肪酸合成关键酶ACC和ACS的活性(P0.01),同时抑制LPL、ATGL和FAT的表达(P0.01)及脂肪酸分解关键酶HSL和CPT-1的活性;而干扰FABP4则抑制培养基中FFA的释放和PPARγ、CEBPα、FAS、ACC、FATP1和LPL的表达,上调ATGL和FAT的表达(P0.01)。 4. FABP4超表达组中PGC-1α、NRF-1、TFAM、CPT-1、MDH-1和UCP-1的表达水平显著下降(P0.01),而干扰组中均上升(P0.01);流式细胞术检测线粒体膜通透性,结果显示过表达FABP4降低了线粒体膜电位,而干扰组上调了线粒体膜电位(P 0.01);FABP4超表达组中Cytc的mRNA和蛋白表达显著下降(P0.01),且荧光强度也明显低于对照组,而干扰组荧光强度增强,Cytc的表达量也显著升高(P0.01)。 5. FABP4高表达显著抑制了脂肪细胞中p38MAPK和ERK的磷酸化水平,促进TOR蛋白磷酸化(P0.01);而干扰FABP4后p38MAPK和ERK磷酸化水平显著上升,TOR蛋白磷酸化水平显著下降(P0.01)。 综上所述,本研究证明了超表达FABP4显著促进脂肪细胞分化和脂质沉积,干扰FABP4基因则显著抑制脂肪细胞分化;超表达FABP4下调脂肪细胞中氧化呼吸相关因子的表达并降低线粒体膜电位,抑制线粒体功能,干扰FABP4基因则能够促进线粒体膜维持高电位,利于增强线粒体的功能; p38MAPK、ERK和TOR信号通路参与了FABP4对线粒体功能的调节。


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