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牛FABP4基因代谢功能研究及品种间脂肪细胞发育特性分析

魏胜娟  
【摘要】:本研究旨在通过过表达和干扰技术,从分子水平和细胞水平研究脂肪酸结合蛋白4(FABP4, fatty acid binding protein4)对牛前脂肪细胞分化及脂质代谢相关基因表达的作用。此外,利用和牛与安格斯牛为实验供体,分析比较了两个牛品种皮下脂肪组织的组织学差异及前脂肪细胞体外增殖分化的异同,为培育高品质肉牛品种奠定基础。主要研究内容如下: (1)构建了牛FABP4基因的腺病毒过表达载体与有效的干扰载体,包装后分别获得了高滴度重组腺病毒AD-FABP4与AD-shRNA-261。利用酶消化法分离得到牛原代培养的前脂肪细胞,将腺病毒AD-FABP4与AD-shRNA-261分别感染牛的前脂肪细胞24小时, FABP4基因的mRNA表达水平可分别提高176%(P 0.01)和降低41%(P 0.01),表明AD-FABP4与AD-shRNA-261可用于介导目标基因FABP4的表达研究。 (2)利用实时荧光定量PCR(polymerase chain reaction)技术,通过过表达和干扰两个方面,探索FABP4在牛的前脂肪细胞分化及脂质代谢中的功能。研究表明,作为PPARγ(peroxisome proliferator-activated receptor γ)信号通路下游的FABP4基因不能反馈调节脂肪细胞分化相关基因PPARγ、CEBPA(CCAAT/enhancer-binding protein A)及SREBP1(sterol regulatory element binding protein1)表达量的变化(P0.05);FABP4基因不影响脂质代谢相关基因FAS(fatty acid synthase)及FATP1(fatty acid transportermember1)的表达(P0.05),但能在转录水平正向调控ADIPOQ(adiponectin)与LEP(leptin)基因的表达(P 0.05)。FABP4在牛的脂肪细胞脂质代谢调控网络中起着重要作用。 (3)制备了和牛与安格斯牛的皮下脂肪组织石蜡切片并进行了苏木精伊红(HE,hematoxylin and eosin)染色,比较了两个牛品种皮下脂肪组织的组织学差异;分离培养了和牛与安格斯牛的原代皮下前脂肪细胞,利用油红O染色技术、实时定量PCR技术、MTT(3(-4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)检测技术及Westernblotting技术分析比较了两个牛品种的前脂肪细胞增殖分化的差异。分析结果显示,和牛的脂肪组织中成熟脂肪细胞体积较大,脂肪细胞间隙较大;和牛与安格斯牛的原代前脂肪细胞可在体外分化为成熟脂肪细胞,且和牛的前脂肪细胞有积累较少脂质的趋势(P=0.094);和牛PPARγ基因在脂肪细胞mRNA表达水平及脂肪组织蛋白表达水平均低于安格斯牛(P 0.05),在和牛较低的皮下脂肪生成趋势中起重要作用;和牛前脂肪细胞的增殖能力显著高于安格斯牛(P=0.028)且伴随着较高的Erk1/2(extracellularsignal-regulated kinase1/2, P=0.013)活性;FGF2(fibroblast growth factor2)的外源添加可消除两个牛品种间的增殖差异及Erk1/2活性的差异;和牛前脂肪细胞TGF-β3(transforming growth factor β3, P=0.008)和BMP2(bone morphogenetic protein2, P=0.043)基因的表达显著低于安格斯牛,可能在和牛与安格斯牛前脂肪细胞增殖差异中起重要作用。


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