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石灰性土壤解磷细菌分子鉴定与解磷能力及机理初探

潘虹  
【摘要】:【目的】探究北方石灰性土壤作物根际解磷细菌种类、解磷能力及解磷机制,以期筛选出高效稳定的解磷菌株,为制作土壤解磷活性强的生物磷肥提供良好菌株,进而在石灰性土壤上实现以PSB(解磷细菌Phosphate-solubilizing bacteria)替代磷肥、降低磷肥用量、提高作物产量、降低面源污染的目的。 【方法】采集陕西杨凌地区葡萄、猕猴桃、白菜根际土,在无机磷和有机磷细菌培养基上采用稀释涂布法分离解磷细菌。选取平板上菌落周围有明显透明圈(即解磷圈)的菌落进行传代培养,传代三次后,若其D/d(D解磷圈直径,d菌落直径)值大于2,视其为高效稳定的PSB菌株;然后进行革兰氏染色观察细菌形态;根据伯杰氏细菌鉴定手册,测定各菌株的部分生理生化性质,对其进行初步的分类鉴定;然后用简并引物扩增这些菌株16S rRNA基因一个长度约1460bp的片段,测序后在Genbank网站上对其进行序列比对分析,选择相似性较高的典型菌株的序列,再用Clustal X进行多序列比对,最后用MEGA5.1软件中的Neighbor-joining(NJ) Algorithm方法构建系统发育树,用Bootstrap对系统树进行统计检验,鉴定解磷细菌分类地位。为探究PSB的解磷机制,本文对其是否分泌有机酸进行了定性及定量测定,并探究了硝酸盐及碳氮源对PSB有机酸分泌的影响。对有机PSB进行液体培养后,比较了它们发酵液的酸性与碱性磷酸酶活性的强弱。分别用无机磷、有机磷细菌液体培养基及二者等体积混合液体培养基(200rpm,28℃)培养各菌株48h后,比较了它们的解磷活性。为验证PSB的土壤解磷活性高低,向石灰性低磷土壤中浇灌无机PSB发酵液,比较了浇灌前后石灰性土壤无机磷形态的变化。 【结果】本试验分离得到10株PSB菌株,其中2株有机PSB,4株无机PSB,4株双解PSB(既能分解有机磷,也能分解无机磷)。生理生化性质及16S r RNA序列分析结果表明,10株菌中,8株属于芽孢杆菌属(Bacillus),其中4株与腊状芽孢杆菌(Bacillus cereus)相似,2株与苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)相似,1株与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)相似,1株与Bacillus aryabhattai相似;剩余两个菌株分别与耐寒短杆菌(Brevibacterium frigoritolerans)、杨氏柠檬酸杆菌(Citrobacteryoungae)聚在一起。本文分离到的无机PSB主要分泌草酸和酒石酸,硝酸盐能显著促进无机PSB有机酸的分泌;有机PSB碱性磷酸酶活性大于酸性磷酸酶活性;10株PSB在不同培养基中解磷能力有差异,固体培养基中WY1的D/d值最大,液体培养基中的解磷量在1~20μg(/109/ml)。石灰性土壤分别浇灌4种无机PSB发酵液后,Ca2-P、Ca8-P含量增加明显,而Fe-P、Al-P含量不同程度减少,Ca10-P和O-P的含量变化不大。菌株之间的解磷活性有较大差异。其中菌株W3的土壤解磷活性最强。 【结论】石灰性土壤作物根际PSB具有物种多样性;硝酸盐能显著促进无机PSB分泌有机酸;无机PSB在土壤中的解磷能力有较大差异。选择解磷菌株应以菌株的土壤的解磷能力为判断依据。


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