收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

转Nramp1基因克隆牛的研制

李倩  
【摘要】:结核病是一种全球性的、人畜共患传染病,是严重危害养殖业和人类健康的重大疫病之一。由于没有有效的预防和根除方法,目前主要采用检疫-扑杀结合的方法。结核病的发生与机体的抗病力密切相关,因而,如何提高机体的抗结核能力一直是人们关注的焦点。近年来,病原-宿主相关作用机制研究的深入、基因编辑技术和动物克隆技术的快速发展,使抗结核牛羊的培育和生产成为可能。研究显示,机体对结核分支杆菌的抵抗力强弱与天然免疫力相关巨噬细胞蛋白1(Nramp1)的表达存在量依赖性关系。因此通过转基因手段来增强牛Nramp1基因表达,培育抗病种群,可成为控制牛结核病的一个新切入点。本研究分别克隆了秦川牛Nramp1开放阅读框及荷斯坦奶牛Nramp1基因启动子区(5’侧翼区-1483~+73)序列,构建了牛Nramp1吞噬细胞特异性真核表达载体,转染荷斯坦奶牛新生牛成纤维细胞,筛选阳性克隆作为核移植供体细胞,生产培育转Nramp1基因克隆牛,取得以下结果:1.基因克隆、载体构建与功能验证。以秦川牛外周血总RNA为模板PCR扩增Nramp1基因开放阅读框,获得的序列对比Gen Bank中的牛的相应的基因序列(Gen Bank序列号U12862.1),发现存在2个碱基差异:第1个差异碱基致使基因编码的第49个氨基酸发生变化使苏氨酸(ACA)转变为丙氨酸(GCA);第2个差异碱基并未引起其编码氨基酸的差异,即第53位氨基酸均为精氨酸(AGG→CGG)。荷斯坦奶牛Nramp1基因5’侧翼区(-1483~+73)序列在巨噬细胞内有启动子活性,且H37Ra可以诱导调节该区段的启动子活性。使用牛Nramp1基因5’侧翼区(-1483~+73)序列调控Nramp1基因表达,构建了牛Nramp1吞噬细胞特异性表达载体p Lox P-2A-N。载体p Lox P-2A-N中使用FMDV 2A自剪肽连接GFP与Neo基因,并在细胞筛选标记基因两侧添加同向的Lox P位点。将该片段分别转入E.coli BM25.8菌株和HEK293,经菌体Cre酶及Cre酶细胞共孵育实验均证明在Cre酶的作用下,Lox P可有效去除中间的筛选标记基因,但序列中会残存一个Lox P位点。2.转基因细胞株的筛选与鉴定。线性化载体p Lox P-2A-N转染奶牛成纤维细胞获得转Nramp1基因细胞株D4、E3。Q-PCR鉴定2株细胞外源基因拷贝数为1。染色体步移试验检测出D4株外源基因插入第29号染色体、E3外源基因插入第10号染色体,两细胞株外源基因插入位点均位于基因组非编码区内。细胞核型试验证明2株细胞染色体数目均为60条。3.核移植与转基因牛生产、鉴定。以D4、E3作为核移植供体细胞生产的转Nramp1基因重构胚胎体外及体内发育率正常,获得3头犊牛(大于2月龄)经PCR与Soutern Blot鉴定均为转Nramp1基因克隆牛。Q-PCR分析外源基因插入没有影响其插入位点上下游基因m RNA的表达水平。分离转基因牛与非转基因牛(供体细胞来源)外周血单核细胞诱导为巨噬细胞。结核分支杆菌H37Ra侵染牛MDMs。正常培养条件下,转基因牛MDMs Nramp1基因表达量与非转基因牛差异不显著;攻菌后,转基因牛MDMs Nramp1基因表达量显著高于非转基因牛。攻菌3 d后,转基因牛MDMs细胞荷菌数显著低于非转基因牛。说明秦川牛Nramp1基因的转入增强了荷斯坦奶牛MDMs对结分支核菌的抑制与杀伤作用,即转入Nramp1增强了牛对结核分支杆菌的抵抗能力。4.SCNT胚胎早期发育阶段体外培养体系的确立。通过SCNT检测胚胎发育率、囊胚细胞总数、ROS水平、囊胚细胞凋亡率和ICM比例指出牛SCNT胚胎体外培养全程添加Vit-C可以提高胚胎卵裂率但降低囊胚孵化率,降低了胚胎质量与发育能力。在转基因牛培育过程中不适宜使用Vit-C作为添加剂。综上所述,本研究获得3头转Nramp1基因克隆牛,完善了转基因牛生产技术体系。从增强动物体自身天然免疫力角度出发,通过转基因手段培育抗病种群,为牛结核病的防控创造一个新切入点。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 程宁辉,胡建广,赵相山,李添生,高燕萍,杨金水;光照和黑暗条件下大豆和玉米基因表达差异的初步研究[J];复旦学报(自然科学版);1997年05期
2 杜占文;后生说:基因决定论的挑战者[J];国外科技动态;2001年10期
3 AnnGibbons,李大卫,何方淑;哪些基因造就了人类[J];世界科学;1999年04期
4 王大力;黄大鹏;;基因表达系列分析技术研究进展[J];动物医学进展;2009年04期
5 包俊英,余新炳,吴忠道;比较基因的表达分析[J];热带医学杂志;2001年02期
6 石胜军,夏照帆;基因表达差异分析方法进展[J];中华病理学杂志;1998年06期
7 鲁凤民,刘霜,吴卫东,安文锋,刘翔,刘世杰;mRNA差异展示法检测氧化镍所致基因表达差异[J];北京医科大学学报;1998年01期
8 杜娟,林戈,卢光琇;人胚胎干细胞和分化细胞差别基因的筛选[J];遗传学报;2004年09期
9 印莉萍,刘维仲,刘祥林,柴小清,邱泽生,张福锁;DDRT-PCR分析铁高效和铁低效小麦品种基因表达的差异[J];首都师范大学学报(自然科学版);2000年02期
10 邢少辰,林秀峰;分离基因的有效手段-mRNA差异显示技术[J];吉林农业科学;2004年02期
11 马淑华,王敦成,邹宗亮,沈倍奋,王升启;应用cDNA芯片分析79个新基因的人胚组织表达谱[J];生物化学与生物物理进展;2001年04期
12 戈艳萍;胡雁;;分泌型天冬氨酸蛋白酶基因表达差异及其影响因素[J];国际口腔医学杂志;2010年06期
13 何玲,赵卉,于娜,潘泽民;介绍cDNA基因和差异表达基因的克隆技术[J];农垦医学;2004年02期
14 李乐群,韩文玲,李怡凡,马大龙,范少光,丁桂凤;利用SSH技术研究小鼠淋巴组织中与束缚应激相关的基因[J];科学通报;1999年09期
15 傅春江,孙严,岳文;利用生物信息学资源进行差异表达ESTs的分析与新基因的克隆[J];实用肿瘤学杂志;2004年05期
16 鲁林荣,郑仲承;mRNA差别显示技术──一种鉴别差异表达基因的新方法[J];生命的化学(中国生物化学会通讯);1994年06期
17 王夏;快速、有效筛选新的功能基因——差异显示技术[J];微生物学通报;2003年02期
18 徐海军;印遇龙;孔祥峰;黄瑞林;;基因网络中基因关系图谱的构建及其应用(英文)[J];生物信息学;2008年02期
19 季芳;张艳春;靳丽莎;郝香芬;夏机良;李学家;张秀娟;饶军华;刘晓明;彭白露;;2型糖尿病相关基因在人和食蟹猴外周血白细胞中的表达模式[J];四川动物;2012年02期
20 熊志红,庄玉辉,李国利;差显技术分析结核杆菌H37Rv与H37Ra差异表达的基因[J];微生物学通报;2005年03期
中国重要会议论文全文数据库 前6条
1 张文俊;江华;赵耀忠;朱晓海;刘安堂;;皮肤恶性黑色素瘤与良性痣基因表达差异的研究[A];第四届华东六省一市整形外科学术会议暨2007年浙江省整形、美容学术会议论文汇编[C];2007年
2 杨劲松;郑新民;陈诗书;;诱导PTPα表达24小时NIH3T3细胞基因表达差异的研究[A];中国生物化学与分子生物学会第八届会员代表大会暨全国学术会议论文摘要集[C];2001年
3 孟金萍;刘云波;张以河;孙淑华;王艳蓉;吕凤柱;杨旭;;铅暴露U251细胞基因表达谱改变及基因通路分析[A];实验动物与药理学、毒理学研究学术交流会论文汇编[C];2009年
4 刘丹慧;陈少松;罗崇林;肖雪媛;何大澄;;一个在肺癌中缺失的基因的筛选与初步研究[A];中国细胞生物学学会2005年学术大会、青年学术研讨会论文摘要集[C];2005年
5 宾晓农;谭敏;吕嘉春;蒋义国;陈家堃;;基因芯片筛选BPDE转化16HBE相关基因的研究[A];第五届广东省环境诱变剂学会暨第三届广东省预防医学会卫生毒理专业委员会学术交流会论文集[C];2006年
6 霍晓芳;张俊武;;红系分化相关基因的鉴别与功能研究[A];中国遗传学会七届一次青年研讨会暨上海高校模式生物E——研究院第一届模式生物学术研讨会论文汇编[C];2005年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 李倩;转Nramp1基因克隆牛的研制[D];西北农林科技大学;2015年
2 朱明库;番茄SlNAC4和SlDEAD31基因在果实成熟及非生物胁迫响应中的功能研究[D];重庆大学;2015年
3 陈鹏程;人类分子相互作用在线资源及多物种的基因集功能关联分析工具的建立[D];浙江大学;2015年
4 孙占斌;粉红螺旋聚孢霉67-1菌寄生相关基因的筛选与功能研究[D];中国农业科学院;2015年
5 韩洪强;控制茄子果型相关性状关键基因的克隆及功能研究[D];上海交通大学;2014年
6 王堃;牦牛基因组遗传变异图谱和高原适应的转录组研究[D];兰州大学;2015年
7 李鑫;小鼠腭裂相关基因的克隆、筛选及功能的研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年
8 孙各琴;幽门螺杆菌可塑区JHP947基因功能的初步研究[D];福建医科大学;2008年
9 周津;食管上皮癌变不同时期差异表达基因与基因表达概况的分析[D];中国协和医科大学;2000年
10 汪金荣;一个人类睾丸特异表达新基因-septin 12 transcript variant 2的克隆与功能初步研究[D];中南大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 孙姣姣;棉铃虫Serpin基因的克隆、表达及Feeding RNAi分析[D];河北大学;2015年
2 韩国英;棉铃虫和HaCHS和CDA基因的克隆、表达及Feeding RNAi分析[D];河北大学;2015年
3 汤常永;梨‘中矮1号’矮生基因的筛选及PcAHS克隆与表达分析[D];中国农业科学院;2015年
4 王庆峰;胶质类芽孢杆菌胞外多糖调节及相关基因的转录分析[D];中国农业科学院;2015年
5 崔淼;飞蝗海藻糖酶基因的分子特性及功能研究[D];山西大学;2014年
6 郝妍妍;玉米ZmSTKR基因的表达及其蛋白的磷酸化分析[D];华中农业大学;2015年
7 申艳;Let-7b通过其靶基因-TGFβR Ⅰ调控羊驼毛生长的研究[D];山西农业大学;2015年
8 贺望兴;灵芝全局性调控基因LaeA的克隆及其在灵芝酸生物合成过程中的差异表达[D];福建师范大学;2015年
9 唐奇;CRYAB基因在HCC中的表达、临床预后分析及抗凋亡功能研究[D];南京医科大学;2007年
10 杨波波;不同肿瘤基因表达分析中内参基因的选择和研究[D];西北大学;2014年
中国重要报纸全文数据库 前4条
1 吴一福;第四军医大学发现抑癌新基因[N];中国医药报;2008年
2 柯尊洪;基因技术在中药研究中的作用[N];中国中医药报;2002年
3 王兴 闫智勇 郝晓锋;借助基因技术发展现代中药[N];中国医药报;2003年
4 本报记者 吴红月;医院病理科借助基因检测延伸新服务[N];科技日报;2014年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978