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大豆疫霉菌阶段发育和毒性变异相关小RNA的鉴定及分析

王秦虎  
【摘要】:病原菌严重影响植物的生存、生长和生殖等,危害巨大。植物病原卵菌可造成毁灭性的作物生产损失,威胁自然生态系统。卵菌为二倍体真核微生物,其形态和生理上与丝状真菌相似,但在进化上与硅藻和褐藻更近,多数杀真菌剂对卵菌病害的防控无效。卵菌包括疫霉菌、霜霉菌、腐霉菌和白锈菌等。引起爱尔兰大饥荒的致病疫霉菌,每年仍可造成多达67亿美元的经济损失。引起大豆幼苗倒伏或大豆根腐病的大豆疫霉菌,每年造成约10-20亿美元的经济损失。作物病害最有效的防控依赖于抗病性的利用,然而病菌的遗传变异,包括可能的表观遗传变异,频频引起作物抗病性丧失。许多研究者多次观察到疫霉菌的表观遗传现象。小RNA分子,例如si RNA,mi RNA和pi RNA,可通过反义互补配对引起转录水平和转录后水平基因沉默,是真核生物重要的表观遗传调控分子。然而,我们对疫霉菌的小RNA的种类、特征、功能和作用方式等知之甚少。为此,我们以大豆疫霉菌为模式,对其阶段发育和毒性变异相关的小RNA进行分析,主要研究结果如下:1、通过深度测序、计算机识别、传统克隆和Northern杂交等方法,在大豆疫霉菌基因组中发现了大量ts RNA分子(t RNA来源的小RNA分子)。利用自主开发的软件ts RFinder对大豆疫霉菌营养菌丝小RNA的重测序和Northern杂交分析结果表明,t RNA reads富集在29-36 nt,最高峰在33 nt,其5’第一个碱基偏好于碱基G,其次为T。在28-45 nt的小RNA中,t RNA reads高达12.34%,丰度最高的ts RNA-Gly CCC-5p占总reads的2.05%。2、基因组分析和Northern杂交分析表明,ts RNA是一类保守的小RNA分子。Northern杂交分析还表明,其表达模式也相对保守:大多数ts RNA在卵孢子、营养菌丝和孢子囊时期高表达,在侵染和萌发的休止孢时期低表达,而在休止孢时期几乎不表达。通过生物信息分析,我们预测到多个ts RNA候选靶标基因。数字基因表达谱、实时定量反转录PCR等结果表明,大部分候选靶标基因表达模式与ts RNA的表达模式负相关。因此,疫霉菌ts RNA分子可调控靶标基因的表达。3、利用RNA定量和RLM-RACE技术(RNA连接介导的c DNA末端快速扩增技术),确认并捕获到5个靶标基因在大豆疫霉菌菌丝中的降解产物。然而,这些ts RNA靶标基因降解位点不在小RNA的结合位点,与已知的mi RNA介导的靶基因降解机制差异较大。与RLM-RACE结果一致,高通量RNA末端并行测序表明,ts RNA可介导靶基因在邻近结合位点的位置降解,略偏好于其结合位点下游区域。疫霉菌瞬时转化分析表明,疫霉菌ts RNA可序列特异的抑制GUS人工靶标基因的表达。因此,疫霉菌ts RNA分子可与靶标基因反义匹配并引起m RNA降解。4、通过对大豆疫霉菌效应基因Avr1b-1沉默菌株的小RNA深度测序和Northern杂交分析,发现两类与Avr1b-1同源的小RNA分子:即Avr1b-1沉默的触发子Avr1b-1-s RNA和沉默信号Avr1b-1-si RNAs。杂交结果还表明,这两类小RNA都在毒性菌株中累积,而在无毒菌株中不累积。其中,触发子Avr1b-1-s RNA比沉默信号Avr1b-1-si RNAs的累积早12-24小时。进一步的生物信息分析和Northern杂交分析表明,大豆疫霉菌中存在大量与RXLR效应蛋白基因同源的小RNA分子,并且RXLR基因的表达呈负相关。5、基因组分析和反转录PCR数据表明,Avr1b-1位点是双向转录的,其形成的天然反义转录本对为Avr1b-1-s RNA的前体,并通过其产物触发子Avr1b-1-s RNA来调控无毒基因Avr1b-1的表达。反转录PCR数据还表明,Avr1b-1反义链Avr1b-1(-)的差异表达对触发子Avr1b-1-s RNA在毒性菌株和无毒菌株间的差异累积负责。进一步的序列分析表明,Avr1b-1(+)和Avr1b-1(-)的表达水平与其启动子中10 nt左右INDEL(插入和缺失变异)的存在和缺失相关联。


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