耐辐射异常球菌丙氨酸代谢相关基因在氧化胁迫应答中的作用及其调控

【摘要】：耐辐射异常球菌(Deinococcus radiodurans)是现有已知生物中对氧化性胁迫具有超强抗性的物种之一。胞内代谢和很多理化效应(如紫外辐射、电离辐射、干燥、过氧化氢等)产生的活性氧都可引起氧化性胁迫。至今,对耐辐射异常菌极端氧化性抗性分子调控机制的了解不是十分清楚,尤其是胞内游离氨基酸对极端氧化抗性作用缺乏认识。本论文从耐辐射异常球菌全局调控蛋白Irr E入手,开展紫外辐射胁迫条件下的转录组分析,研究Irr E对胞内有关氨基酸代谢基因的影响,着重分析了Lrp家族丙氨酸脱氢酶调控蛋白Ald R(DR_1894)的作用。研究进展如下:1.Irr E作为全局调控蛋白,其突变导致菌株对辐射氧化高度敏感,转录组分析显示,在正常和UV辐射处理以后Irr E使得92个基因显著上调和86个基因显著下调(变化2倍以上,P≤0.05)。根据COG分类这些基因分为3类:信息的存储和处理、代谢以及少有研究的,其中DNA损伤修复相关的基因ppr A、ddr B、ddr A、ddr D、mut S、mut L、ruv B等显著下调。另外,Irr E突变引起了氨基酸代谢相关基因表达的变化,如dr_0958和dr_0959(peptide ABC transporter permease),dr_0965和dra0127(GMC oxidoreductase)以及dr_1895(ald,编码丙氨酸脱氢酶)。RT-PCR分析验证ald基因等的表达显著下调,这说明Irr E可能会影响胞内丙氨酸的代谢。2.为了研究Irr E对细胞内氨基酸代谢的影响,利用HPLC的方法测定了irr E突变株不同胁迫冲击下胞内的游离氨基酸含量,正常生长条件下,野生型和irr E突变株胞内游离氨基酸总含量分别为40.6±1.7和39.1±3.9 mg/g干细胞,热激后分别为40.2±4.0和36.8±0.3,UV处理后分别为19.5±0.3和22.2±1.4以及H2O2处理后为38.7±2.9和38.5±1.0,其中含量较高的谷氨酸、丙氨酸、亮氨酸、赖氨酸等发生了不同程度的变化,如正常生长条件下,野生型和irr E突变株胞内游离丙氨酸含量分别为6.4±0.2和5.8±0.7,UV处理后分别为3.3±0.1和4.3±0.3。以上结果表明Irr E影响了胞内氨基酸代谢,参与了丙氨酸代谢的调控。3.初步研究发现ald基因的表达可能直接受DR_1894蛋白的调控。为了研究DR_1894的功能,我们首先运用生物信息学方法对其进行分析,结果表明DR_1894蛋白属于典型的Lrp家族调控蛋白,与下游基因ald可能构成基因簇,具有Mycobacterium smegmatis丙氨酸脱氢酶调控蛋白Ald R特性。RT-PCR结果发现在不同胁迫(高温、重金属、H2O2,冷、UV)条件下,ald R基因的表达表现了不同程度的诱导表达。胁迫抗性分析发现ald R突变株对紫外、干燥、低温等理化胁迫的抗性与野生型一致,但是对于过氧化物(过氧化氢异丙苯,过氧化氢)敏感,存活率要比野生型低1-2个数量级。RT-PCR结果显示过氧化氢冲击后,ald R突变株中一些氧化抗性基因表达量下调,如oxy R、sod C、kat E、osm C、grx等。结果表明Ald R对耐辐射异常球菌的氧化抗性具有重要作用。4.为进一步探究Ald R与ald之间的调控关系,我们利用Biolog方法、特定培养基利用丙氨酸实验,发现ald R突变株对丙氨酸的利用能力弱于野生型。同时在特定培养基中培养到稳定期时,ald R突变株菌体的干重小于野生型。启动子分析发现ald启动子中含有Ald R的可能结合的反向重复区域CGCAACCGCGTTGCG。通过β-半乳糖苷酶活性的测定,ald启动子活性在ald R突变株中要比在野生型中的活性低3倍左右。另外我们发现ald R突变株对氯化钠和山梨醇抗性弱于野生型,也说明了ald R的突变会影响胞内渗透保护物质丙氨酸的含量。最后我们利用HPLC测定了不同条件下ald R突变株的游离氨基酸的含量,发现突变株中丙氨酸的含量确实发生了发生了变化。上述研究结果表明Ald R调控ald基因的表达,影响了胞内丙氨酸含量。总之,Irr E作为全局调控因子影响了耐辐射异常球菌的胞内代谢,特别是丙氨酸代谢。耐辐射异常球菌的氨基酸代谢(丙氨酸代谢)影响了其极端的胁迫抗性,但是具体的调控机制还有待进一步研究。