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转植酸酶和内切葡聚糖酶基因乳酸杆菌的构建及其肉鸡饲喂效果验证

王磊  
【摘要】:β-葡聚糖和植酸(盐)是单胃动物日粮中主要的两种抗营养因子,对蛋白质、脂类、矿物质离子等营养素均具有极强的吸附和螯合能力,同时单胃动物(如猪和家禽)胃肠道缺乏或很少分泌β-葡聚糖和植酸降解酶,导致一些营养素的消化和吸收率降低,大量营养素被排泄到体外,造成对环境的污染。在实际生产中,通过添加外源性饲料酶制剂可在一定程度上消除这两种抗营养因子的不良影响,但也增加了饲料成本,且只能取得短期的效应,同时在饲料制粒过程中,酶制剂易因高温而失活;因此运用基因工程技术,构建能够表达和分泌水解酶类的乳酸杆菌重组菌,将是一种可替代的和廉价的策略。本研究的目的在于从自然界中筛选具有高植酸酶活性或内切葡聚糖酶活性的菌株,并克隆其对应的植酸酶基因和内切葡聚糖酶基因,同时从肉鸡肠道内筛选和鉴定优势益生乳酸杆菌作为宿主菌,通过基因工程技术将两个酶基因同时克隆到乳酸杆菌中,构建既具有益生特性又具有植酸酶活性和内切葡聚糖酶活性的多功能转基因乳酸杆菌,以低有效磷水平的大麦-小麦型日粮为基础日粮,验证其肉鸡饲喂效果,以此来改善肉鸡营养素利用率、提高肉鸡生产性能、降低肉鸡肠道疾病发生率、节约饲养成本,并为多功能转基因乳酸杆菌在动物生产中应用提供理论依据和技术支持。主要研究结果如下: 1.从自然界中分别筛选出1株产内切葡聚糖酶的细菌和1株产植酸酶的真菌,经菌落形态、染色观察及16S和18S保守序列测序鉴定,WL001为枯草芽孢杆菌,WL002为烟曲霉。Bacillus. subtilis WL001发酵产内切葡聚糖酶的最佳碳源为麸皮,氮源为蛋白胨,初始pH为6-7,培养时间为24h;Aspergillus. fumigatus WL002发酵产植酸酶的最佳碳源为麸皮,氮源为蛋白胨,初始pH为5-6,培养时间为24h。B. subtilis WL001内切葡聚糖酶和A. fumigatus WL002植酸酶反应的最适温度均为60℃,最适pH分别为5.5和5.5-6.5。 2.从B. subtilis WL001基因组DNA中成功克隆内切葡聚糖酶基因,大小1500bp,命名为celW,获得Genbank登录号(No. KJ528404);内切葡聚糖酶基因在Ecoil BL21(DE3)中实现可溶性表达,蛋白分子量为55kD,胞内上清内切葡聚糖酶活性为1.18U/ml。从A. fumigatus WL002基因组DNA中成功克隆植酸酶基因成熟肽,大小1320bp,命名为phyAW,获得Genbank登录号(No. KJ528403);植酸酶基因成熟肽在EcoilTransetta (DE3)中实现可溶性表达,蛋白分子量为48.2kD,胞内上清植酸酶活性为0.64U/ml。 3.乳酸杆菌在肉鸡嗉囊中密度最大、分布最广,在盲肠中密度最小、分布最少,大多集中分布在肉鸡肠道前端。L. reuteri、L. johnsonii、L. acidophilus、L. crispatus、L.salivarius和L. aviarius是贯穿于整个肉鸡肠道的优势乳酸杆菌。L. reuteri是肉鸡肠道最丰富的乳酸杆菌。L. reuteri XC1具有良好的益生特性,是理想或潜在的基因工程宿主菌。 4.成功构建了内切葡聚糖酶基因乳酸杆菌表达质粒、植酸酶基因乳酸杆菌表达质粒及其共表达质粒,分别命名为pLEM4157(cel)、pLEM4158(phy)、pLEM4159-cel/phy。通过电转化和平板筛选,获得相应的具有内切葡聚糖酶活性(0.96±0.08U/mL)的转基因乳酸杆菌L. reuteri pLEM4157(cel)、具有植酸酶活性(0.51±0.13U/mL)的转基因罗伊乳酸杆菌L. reuteri pLEM4158(phy),及同时具有内切葡聚糖酶和植酸酶活性(内切葡聚糖酶活性0.68±0.17U/mL;植酸酶活性0.42±0.05U/mL)罗伊乳酸杆菌L. reuteripLEM4159-cel/phy。转基因罗伊乳酸杆菌获得与野生型罗伊乳酸杆菌相似的酸和胆盐耐受特性,当pH为2.0和3.0时,其成活率分别是13%和21%左右,当胆盐浓度为0.3%和0.5%时,其成活率分别是10%和0.3%左右。 5. L. reuteri pLEM4158(phy)和L. reuteri pLEM4159-cel/phy可改善21–42日龄肉仔鸡饲料转化率;L. reuteri pLEM4157(cel)、L. reuteri pLEM4158(phy)和L. reuteripLEM4159-cel/phy可改善整个饲养期(1-42d)肉仔鸡饲料转化率,但对肉仔鸡日增重和日采食量无显著影响。 6. L. reuteri pLEM4159-cel/phy可提高21日龄肉仔鸡胫骨灰分、钙和磷水平;L.reuteri pLEM4157(cel)可提高21日龄肉仔鸡胫骨钙水平;罗伊乳酸杆菌组21日龄肉仔鸡胫骨磷含量呈现增加的趋势,对21日龄肉仔鸡胫骨钙的沉积有轻微的促进作用;L.reuteri pLEM4158(phy)可提高42日龄肉仔鸡胫骨磷水平。 7.饮水饲喂转基因罗伊乳酸杆菌能降低肉仔鸡21日龄和42日龄十二指肠、空肠pH,对肉仔鸡屠宰性能无显著影响,仅可轻微降低腹脂率,可显著降低胸肌滴水损失、蒸煮损失和剪切力,提高肌肉的嫩度。 8. L. reuteri pLEM4159-cel/phy可显著提高21日龄和42日龄肉仔鸡十二指肠绒毛高度;L. reuteri pLEM4158(phy)、L. reuteri pLEM4159-cel/phy和L. reuteri pLEM4157(cel)可显著降低21日龄肉仔鸡十二指肠和空肠隐窝深度,增加21日龄肉仔鸡空肠肠壁厚度,降低42日龄肉仔鸡回肠隐窝深度,增加42日龄肉仔鸡十二指肠绒毛高度;L. reuteri pLEM4158(phy)和L. reuteri pLEM4159-cel/phy可显著提高42日龄肉仔鸡回肠绒毛高度和绒毛宽度。 9. L. reuteri pLEM4159-cel/phy可显著降低21日龄肉仔鸡盲肠大肠杆菌的数量;L.reuteri pLEM4157(cel)可显著降低肉仔鸡盲肠韦荣球菌的数量;饲喂转基因罗伊乳酸杆菌,21日龄肉仔鸡盲肠大肠杆菌、韦荣球菌和拟杆菌的数量呈现降低的趋势,双歧杆菌和乳酸杆菌的数量呈现增加的趋势,42日龄肉仔鸡盲肠乳酸杆菌和粪肠球菌的数量呈现增加趋势。 综上所述:本研究获得1株产内切葡聚糖酶的B. subtilis WL001和1株产植酸酶的A. fumigatus WL002;成功克隆目的基因,并实现大肠杆菌可溶性表达。L. reuteri是鸡肠道最丰富的乳酸杆菌。L. reuteri XC1具是理想或潜在的基因工程宿主菌。获得具有益生特性、内切葡聚糖酶和植酸酶活性的多功能转基因乳酸杆菌。重组的罗伊乳酸杆菌对肉仔鸡饲料转化率、胫骨特性、肠道pH、小肠组织形态和盲肠微生物菌群有一定的改善作用。


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