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马铃薯茎尖超低温保存与伤害解析及其脱毒效应研究

王彪  
【摘要】:植物超低温保存被广泛认为是植物种质资源长期保存的最理想方法。超低温保存过程中细胞的多重伤害往往造成材料的恢复率低,这极大地限制了超低温保存的广泛应用。基于超低温保存造成的多重伤害,超低温疗法近年来已发展为一种新的植物病原体脱除技术,提高超低温疗法的效率是发展和完善该生物技术的关键性问题之一。 马铃薯是植物超低温保存研究的模式植物。马铃薯的病毒病是严重危害其生产的重要因素之一,而无毒种薯栽培是目前控制其病毒病的主要措施。为此,本研究以马铃薯为试验材料,旨在建立高效广谱的马铃薯茎尖超低温保存技术体系;分析茎尖超低温保存过程中茎尖细胞的组织学伤害,超微结构变化,冰晶伤害、氧化伤害和超低温保存可能造成的再生植株遗传变异;检测超低温脱除马铃薯卷叶病毒(PLRV)和马铃薯Y病毒(PVY)的效果;探究超低温脱毒的机理和提高超低温疗法效率的方法和手段。主要结果如下: 1.以‘紫花白’茎尖为试材,通过优化影响马铃薯超低温保存的关键因素,建立了马铃薯茎尖小滴玻璃化法和玻璃化法两种超低温保存体系。小滴玻璃化法中,取2~3mm大小的茎尖,经0.3M蔗糖预培养2~3d后,用2M甘油和1M蔗糖加载30min,然后在0℃用植物玻璃化溶液(PVS2)处理40min,将茎尖转到铝箔条上后直接投入液氮;玻璃化法中,茎尖经0.45M蔗糖预培养1~2d后,分别用60%和80%PVS2处理30min,然后PVS2处理40min,将茎尖转入含有0.5ml PVS2的超低温管中,投入液氮,两种方法分别获得了75%和48%的植株再生率。将两种方法应用到20个中国主栽的马铃薯品种,获得了62%和36%的平均再生率。此外,将优化的小滴玻璃化法和德国马铃薯超低温种质资源库所应用的DMSO滴冻法进行了比较,Evans Blue染色和形态发生观察发现,经小滴玻璃化法保存茎尖的存活细胞多,再生速度快,再生过程中没有愈伤组织形成;而DMSO滴冻法保存的茎尖存活细胞少,再生速度缓慢,再生过程中产生了大量愈伤组织。两种超低温保存方法应用到6个马铃薯品种,分别获得了平均71%和30%的植株再生率。 2.研究对马铃薯茎尖超低温保存处理过程中的组织学伤害、超微结构变化、冰晶伤害、氧化伤害及可能造成的DNA和染色体倍性的遗传变异进行了评价和解析。在三种基于玻璃化的超低温保存方法中,对马铃薯茎尖进行了组织学伤害和存活细胞比例的定量研究,结果表明,蔗糖预培养不会造成茎尖细胞组织学显著改变,PVS2处理是造成茎尖细胞死亡的主要步骤,液氮冻存并不会明显地改变PVS2造成的茎尖细胞存活模式。小滴玻璃化法和包埋玻璃化法处理的茎尖的整个生长点的细胞几乎都能存活,而玻璃化法处理的茎尖组织学伤害最为严重,生长点的几层顶端细胞仅有一半存活。经这三种基于玻璃化的超低温保存后的再生植株,对其可能发生的遗传变异进行了检测,ISSR和AFLP分子标记及流式细胞仪的检测结果表明,三种超低温保存方法的再生植株DNA和染色体倍性未见变异。比较了小滴玻璃化法和DMSO滴冻法两种超低温冻存方法对马铃薯茎尖细胞的冰晶伤害及其超微结构伤害,差示扫描量热法(DSC)的研究结果表明,DMSO滴冻法的冻融过程中热变化高,在冻融过程中形成了大量的冰晶,且未检测到玻璃态的转化;而小滴玻璃化中,茎尖冷冻过程中发生了玻璃态地转化,解冻过程中发生了轻微的重结晶,茎尖细胞冰晶形成量仅为DMSO滴冻法的1/7,表明小滴玻璃化法的冰晶伤害远远低于DMSO滴冻法。超微结构的观察表明,茎尖经PVS2处理后,生长点的液泡被分解成很多体积较小的泡状体,众多泡状体中,有明显的多酚类物质的积累,生长点和幼嫩叶原基细胞的质体中积累了体积大而且数量众多的淀粉粒。而在DMSO滴冻法中未见多酚类物质和淀粉粒的积累;透射电镜观察表明,小滴玻璃化冻存的茎尖生长点未见明显伤害,而DMSO滴冻法往往导致生长点细胞死亡,仅在幼嫩叶原基里有零星细胞存活。此外,以转基因马铃薯研究了过量表达增加内源抗氧化剂和外施抗氧化剂对茎尖氧化伤害的抑制作用,结果表明,内源增强还原态抗坏血酸和谷胱甘肽以及外施还原态谷胱甘肽均显著地提高了茎尖再生率,而外施AsA对茎尖再生无明显影响。 3.研究证实了超低温保存伤害的脱毒效应和机理。三种基于玻璃化超低温疗法均可有效地脱除PLRV和PVY,脱除率约为80%。免疫组织化学法对病毒的定位研究表明,PLRV病毒仅存在于筛管组织,最多可以侵染到茎尖第四片叶原基及距生长点顶端约0.4~0.5mm的组织。液氮冻存后,仅生长点顶端约十层左右的细胞(约0.2mm)可以存活,结合病毒在茎尖的分布和茎尖存活细胞定位,证实了超低温脱毒的机理。研究发现,第四片或更成熟的叶原基带毒细胞的存活是导致超低温疗法不能完全脱除PLRV的关键因素,通过改良剥取茎尖的方法,证明了带有2~3片叶原基的茎尖,无论大小(0.5~4mm),经PVS2处理可完全脱除PLRV。利用PVS2处理时间调节茎尖细胞的冰晶伤害和超低温保护剂伤害的研究表明,调控两种伤害的大小对超低温疗法脱除PVY的效率并未造成明显地影响。


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