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《西北农林科技大学》 2016年
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大麦黄矮病毒GAV与二穗短柄草互作蛋白的筛选鉴定研究

陶烨  
【摘要】:大麦黄矮病毒(Barley yellow dwarf viruses,BYDVs)是一类在世界范围内广泛分布的重要禾谷类作物病毒,仅通过麦蚜传播,能够侵染多种禾本科作物,引起黄矮病,对世界范围内的农业生产造成了严重损失。在我国,BYDVs主要侵染小麦(Triticum aestivum),导致叶片黄化、分蘖减少等症状,其中造成危害最主要的病原之一是BYDV-GAV。因此,为了更好的控制由BYDV-GAV引起的小麦黄矮病,我们需要对病毒和寄主之间的互作关系,以及病毒的致病机制进行更加深入的了解,这对探索新型的病毒防治方法有着重要的意义。但由于小麦基因组非常庞大,且遗传转化体系不太成熟,致使在小麦上开展病毒-寄主互作及病毒分子致病机制的研究非常困难。二穗短柄草(Brachypodium distachyon)是禾本科的模式植物,具有植株矮小,基因组简单且背景清晰,生命周期短和易于培养等优点。更重要的是,它和小麦的农艺性状相似,染色体组也具有很好的共线性。因此,本研究选用二穗短柄草作为模式寄主,探索了BYDV-GAV和寄主之间的互作关系,筛选和鉴定了与BYDV-GAV的互作的寄主因子,主要研究内容如下:(1)建立了二穗短柄草与BYDV-GAV的互作研究体系。通过蚜虫接种的方法,将BYDV-GAV接种到二穗短柄草Bd21-3上,接种21天后植株表现出叶片变红、严重矮化以及根部萎缩等黄矮病症状,并通过RT-PCR和TAS-ELISA的方法确认了BYDV-GAV的侵染。对健康的和感染BYDV-GAV的二穗短柄草的叶片细胞进行透射电镜观察,发现接种植株的筛管伴胞中存在病毒粒子,叶肉薄壁细胞的叶绿体结构也被严重破坏。以BYDV-GAV侵染的二穗短柄草为毒源进行了蚜传实验,表明BYDV-GAV可以在二穗短柄草之间进行传播。将BYDV-GAV同时接种至二穗短柄草和其自然寄主小麦上,观察和比较了接种21天内的症状扩展情况,并通过TAS-ELISA的方法检测了期间病毒含量的变化,结果表明,与BYDV-GAV的自然寄主小麦相比,二穗短柄草发病更早,表现出了更加严重的黄矮病症状,但病毒的积累模式与小麦非常相似。通过以上实验证明了禾本科模式植物二穗短柄草Bd21-3可以被BYDV-GAV成功侵染,侵染过程与小麦比较相似,因此可以作为研究BYDV-GAV的模式寄主。(2)筛选鉴定了与BYDV-GAV互作的寄主蛋白。首先,通过GatewayTM技术中的LR反应将二穗短柄草的入门文库成功转化成用于酵母双杂交筛选的cDNA文库,并通过半固体法对该文库进行了扩增,最终获得了滴度为1.7×107 cfu/mL的cDNA文库,可用于后续的酵母双杂交筛选。其次,通过GatewayTM技术成功构建了BYDV-GAV的外壳蛋白CP、假定的运动蛋白MP及基因沉默抑制子P6的诱饵载体,并对三个诱饵蛋白进行了自激活检测,确定了文库筛选所需的3-AT(3-氨基三唑)浓度为50mM。再次,通过酵母双杂交的方法,用三个诱饵蛋白分别对二穗短柄草的cDNA酵母文库进行筛选。在SC-Leu-Trp-His+50mM 3-AT平板上获得互作子后,通过检测HIS3、URA3、Lac Z三个报告基因的表达情况确定互作后,对互作蛋白的序列进行分析。结果表明,以CP为诱饵蛋白筛到16个与其存在弱相互作用的蛋白,包括2个假定蛋白,5个叶绿体蛋白(叶绿体磷酸果糖激酶、叶绿体转酮醇酶、叶绿体蛋白转运组件、叶绿体二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶活化酶、叶绿素a/b结合蛋白),以及动力蛋白2A、钙调蛋白3、跨膜蛋白147等;以MP为诱饵蛋白筛选到35个强互作蛋白,序列分析后主要为四个蛋白,分别是14-3-3 like蛋白、转录因子VOZ1、富甘氨酸RNA结合蛋白和26S蛋白酶体的一个亚基类似蛋白;以P6为诱饵蛋白没有筛到任何互作子。最后,将筛选到的猎物载体和诱饵载体重新转化酵母细胞验证,最终确定VOZ1与MP存在互作。(3)验证了MP与VOZ1的蛋白互作。首先,通过原核表达分别获得GST-MP和MBP-VOZ1融合蛋白进行GST pull-down实验,确定MP和VOZ1可以在体外互作。其次,通过农杆菌接种的方法,确定了MP和VOZ1在本氏烟中的亚细胞定位。结果表明,MP主要定位在核膜上,少量定位在细胞质中,VOZ1以聚集的形式在细胞质中存在。最后,通过双分子荧光互补实验(BiFC),结合农杆菌接种的方法,确定MP和VOZ1在烟草细胞内可以互作,并通过DAPI染色确定互作位置在细胞质而非细胞核。综上所述,本研究建立了二穗短柄草与BYDV-GAV的互作体系,在此基础上,以二穗短柄草为模式寄主,筛选和鉴定了和BYDV-GAV的互作蛋白,为进一步解析BYDV-GAV致病的分子机理奠定了基础。
【学位授予单位】:

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