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短柄草—小麦条锈菌互作的表达分析及短柄草NAC转录因子家族功能研究

王冰  
【摘要】:由条形柄锈菌小麦专化型(Puccinia striiformis f.sp.tritici,Pst)引起的小麦条锈病是小麦生产上的一种毁灭性病害。种植小麦抗性品种是生产上最主要的防治手段。由于小麦条锈菌具有极快的变异速度,生产上种植的小麦抗病品种含有的抗性基因大部分已被新的毒性小种克服。因此,发掘和利用新的持久抗锈病基因资源非常重要。非寄主抗性(non-host resistance)是植物对病原菌的所有小种甚至对该病原菌所在的属也具有抗性,而且这种抗性不因病原菌的变异而丧失。因此,非寄主抗性基因的挖掘和利用,对实现小麦条锈病的持久防控具有十分重要的意义。本论文在利用基因芯片技术分析二穗短柄草与短柄草锈菌的寄主互作及二穗短柄草与小麦条锈菌非寄主互作的全基因组表达谱的基础上,对二穗短柄草NAC转录因子在抗锈菌中的功能进行了研究,明确了它们在条锈菌侵染致病中的作用。本论文为揭示短柄草与小麦条锈菌的非寄主抗性机制,挖掘二穗短柄草非寄主抗性基因奠定了基础。主要研究结果如下:1.短柄草与小麦条锈菌非寄主互作的基因表达分析通过在二穗短柄草上分别接种短柄草锈菌和小麦条锈菌来区别寄主及非寄主反应的表观特征。在接种短柄草锈菌14天后发现,在短柄草叶表面形成大量的孢子堆。而接种小麦条锈菌CYR31后,二穗短柄草叶表面没有明显的发病症状。组织学观察发现短柄草锈菌侵染前期可以形成吸器及吸器母细胞等关键结构,但接种小麦条锈菌后不能形成上述结构。为了解析短柄草在抵抗短柄草锈菌(寄主防御反应)与小麦条锈菌(非寄主防御反应)早期侵染阶段的基因表达差异,构建了一个二穗短柄草全基因组芯片。芯片分析显示在短柄草和短柄草锈菌的寄主防御组合中有524个基因表达发生显著变化(log2≥1或≤-1,p-value≤0.05)。而在短柄草和小麦条锈菌的非寄主组合中,共有889个基因表达发生显著变化。将两种组合中表达发生显著变化的基因进行比较分析发现,有128个基因在两种组合都存在。qRT-PCR分析的基因表达结果与microarray结果一致。Gene Ontology(GO)分析发现,非寄主防御反应特异表达的基因富集成非常复杂的通路。主要包括茉莉酸通路、植物HR反应、植物先天免疫等抗病相关通路。分析还发现,短柄草在抵御小麦条锈菌侵染过程中,次生代谢和细胞壁生物合成发生显著变化。表明更多的通路参与了短柄草对小麦条锈菌的非寄主抗病反应过程。2.短柄草NAC转录因子功能分析芯片分析发现,大量的短柄草NAC转录因子参与到抗病中。为此,从短柄草全基因组中选取100个二穗短柄草NAC基因进行序列和进化关系分析,筛选了18个与水稻、拟南芥同源性较低的短柄草NAC转录因子,并克隆到其中14个成员。进化树分析发现,18个二穗短柄草NAC成员基本分布在分枝Ⅱ,此区域的转录因子进化差异较大。结构域分析进一步发现,18个二穗短柄草NAC保守结构域相似性较高,而转录激活域差异较大。结果表明,短柄草NAC转录因子转录激活域可能是NAC转录因子功能进化的关键区域。qRT-PCR分析发现,二穗短柄草NAC转录因子主要在叶部和根部表达。二穗短柄草与短柄草锈的寄主互作表达分析发现,4个NAC转录因子在短柄草锈菌侵染的早期(接种24小时)显著上调表达。另外,有8个NAC转录因子的表达在接种前期与对照相比没有显著改变,但接种后120小时,表达受到显著抑制。而在二穗短柄草与小麦条锈菌的非寄主反应中,11个二穗短柄草NAC转录因子上调表达,其中9个二穗短柄草NAC转录因子的峰值出现在二穗短柄草接种小麦条锈菌(CYR31)后的早期阶段。结果表明NAC转录因子在寄主互作与非寄主互作时的表达模式存在差异,特别是病原菌侵染的早期阶段。为了进一步验证二穗短柄草NAC转录因子的功能,利用RNAi技术获得了10个短柄草NAC转录因子的RNAi阳性植株。沉默后表型鉴定发现,2个NAC转录因子的RNAi植株生长表型发生改变。其中BNAC65的RNAi植株株高较野生型显著变矮,而BdNAC67的穗部较野生型显著增大。其余8个RNAi阳性植株生长表型与野生型相比没有显著改变。这些结果表明二穗短柄草NAC转录因子参与到植物的生长发育过程,并在调节器官发育中发挥重要作用。短柄草NAC转录因子的RNAi植株抗病鉴定发现,接种短柄草锈菌F-CO后BNAC95的RNAi植株叶表面出现黑色斑点,且短柄草锈菌不能产孢。而其它RNAi植株与野生型均能正常产孢。接种小麦条锈菌CYR31后组织学观察发现,与野生型相比,小麦条锈菌能够在BNAC37的RNAi植株上产生吸器母细胞,但是不能进一步形成吸器。在二穗短柄草NAC转录因子RNAi植株穗部接种小麦赤霉菌后发现,BNAC32的RNAi植株接种后,发病加快,感病性增强。结果表明二穗短柄草NAC转录因子在抗病过程中发挥了重要的作用,但在抵抗不同病原菌时调节的机理存在差异。这为揭示短柄草的抗病机理,进而为小麦条锈病的抗病遗传改良奠定基础。


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