在烟草中表达猪轮状病毒VP7蛋白的研究

【摘要】：近年来,植物疫苗的开发利用已经成为研究热点,因其具有安全、有效、成本低廉的优势,逐步得到科学界的认同。猪轮状病毒(PRV)是引起猪病毒性腹泻的主要病原微生物之一,是目前危害我国养猪业的一种主要病毒。VP7蛋白是轮状病毒(RV)粒子表面的外壳蛋白,也是RV主要的中和抗原,可以引起机体产生中和抗体,起到免疫保护作用。VP4和VP6蛋白分别是RV的外壳蛋白和内壳蛋白,都是重要的保护性抗原,在预防RV感染时,可与VP7一同刺激机体产生免疫效应。本研究通过构建高效植物表达载体,建立在烟草中表达VP7、VP4和VP6蛋白的遗传转化体系,为开发植物源PRV疫苗奠定基础。试验主要取得如下结果:(1)根据PRV VP7的氨基酸序列,选取能产生中和反应的51-312位氨基酸,用烟草偏爱密码子进行优化人工合成基因序列。在目的基因上游添加Ω序列以增强翻译,下游添加M细胞靶向肽-Col序列增强免疫效应,并添加内质网滞留信号ER序列定向表达蛋白,融合6个His标签用于蛋白的分离纯化。(2)成功构建了pBI121-VP7植物表达载体,通过冻融法转入农杆菌EHA105菌株中。利用农杆菌介导的注射侵染法将VP7基因转入本氏烟草中,经RT-PCR检测、SDS-PAGE及用His-Tag抗体进行Western Blotting分析,初步检测到VP7蛋白的表达。(3)用农杆菌EHA105介导的叶盘法将VP7基因转入普通烟草,经共培养、筛选、分化及生根过程最终得到2株转基因幼苗,通过烟草叶片直接PCR的方法进行鉴定,但未检测到目标条带,还需进一步验证VP7基因是否稳定转化。(4)设计并优化合成了PRV的VP4与VP7融合基因VP4-7以及VP6基因,成功构建了pBI121-VP4-7、pBI121-VP6植物表达载体,为后续在烟草中表达VP4-VP7融合蛋白、VP6蛋白及研发二价或二联植物疫苗奠定基础。