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杨凌糖丝菌Hhs.015全基因组分泌蛋白的预测分析及诱导抗性相关蛋白筛选

郭红梅  
【摘要】:杨凌糖丝菌Hhs.015(Saccharothrix yanglingensis)是由黄瓜根部分离获得的生防放线菌,前期大量试验表明该菌对番茄叶霉病、苹果树腐烂病有明显的防治作用,但目前对其防治机理还不清楚。本研究基于杨凌糖丝菌Hhs.015全基因组测序结果及预测分析到的分泌蛋白,通过构建表达载体,对分泌蛋白进行苹果树腐烂病抗病性检测分析及诱导抗性相关酶活检测,期望筛选得到与植物诱导抗性相关的外泌蛋白,为深入了解杨凌糖丝菌Hhs.015诱导抗性分子机制及苹果树腐烂病的防治奠定基础,为蛋白质生物农药的开发提供思路。本试验中采用相关软件综合分析杨凌糖丝菌基因组中7379条蛋白序列的信号肽、跨膜结构、锚定位点和亚细胞定位等特点,筛选出分泌蛋白并对筛选出的分泌蛋白信号肽的基本特征进行分析,将筛选出的分泌蛋白基因进行外源表达蛋白纯化后,检测蛋白对苹果树腐烂病抗病性及处理苹果叶片后诱导抗病性相关酶的活性。获得以下试验结果:1、利用SingnalP 4.1软件、TMHMM、PrositeScan和big-PIpredictor等程序对杨凌糖丝菌Hhs.015基因组分析预测,对所得的Hhs.015序列进行blast2go分析、功能注释、结构域预测及长度分布分析。分析得出杨凌糖丝菌Hhs.015含有分泌蛋白300个,约占总数的4.07%,其氨基酸长度大多集中在100~400 aa之间,比例约占56%;信号肽长度跨越范围较大,集中在23~27个aa序列之间;信号肽切割位点属于A-X-A类型。其中具有预测功能的外泌蛋白为158个,功能大多数集中在酶类,包括丝氨酸蛋白酶、转肽酶等。2、对筛选出的假定蛋白进行原核表达,从142个未知功能的假定外泌蛋白中挑选出氨基酸长度在100~400 aa的假定外泌蛋白29个,成功构建原核表达载体,对蛋白诱导表达条件温度、IPTG浓度及诱导时间进行优化,得到诱导最佳温度为16~18℃、IPTG最佳浓度为0.1 mmol/L及诱导时间为14~18 h,纯化获得6个候选假定蛋白编号:分别为5620g、1132g、194g、2349g、3176g、3638g。3、将诱导出的6种蛋白分别进行活性检测及抗病性检测。其中6种蛋白不能诱导烟草产生坏死反应。分别对经蛋白液浸泡10 min晾干后的苹果叶片接种苹果树腐烂病菌进行培养,结果经5620g蛋白液浸泡后的苹果叶片对苹果腐烂病菌的抗病性增强,抑制病斑的扩展。4、对5620g蛋白液进行防御酶活性检测。在5620g蛋白液处理苹果叶片后的第1、2、3、4、5、6天进行取样检测过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)及多酚氧化酶(PPO)的活力。POD活性在第3天时达到最高值,与对照相比增加58.2%,PAL活性第3天显著提高113.8%,PPO活性在第4天活性显著提高。通过上述试验成功筛选得到一个植物诱导抗性相关的蛋白激发子5620g,为明确杨凌糖丝菌Hhs.015诱导抗性分子机制奠定基础。


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