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核桃高活性内生真菌筛选及其代谢产物抑菌活性的研究

刘泽星  
【摘要】:为研究陕西核桃内生真菌的生态多样性和分布特征,从宜君、蓝田、山阳3个采样地,春夏秋冬4个季节的核桃树根、一年生茎、两年生茎、干茎、叶和果6种组织部位采集试验样本;通过组织分离法获得内生真菌,以形态学特征鉴定和分子生物学方法鉴定归属。通过拮抗试验、生长速率法和滤纸片法等试验方法筛选高活性内生真菌;极性分离高活性菌株的发酵代谢产物,通过病原菌生长速率试验和离体试验跟踪代谢产物中的生物活性成分;最后应用代谢组学检测分析目标菌株的生物活性物质。主要研究结果如下:(1)从核桃组织中分离出隶属于65个属的2485株内生真菌,其中交链孢霉属(Alternaria)内生真菌为绝对优势菌属。从不同组织部位看,核桃两年生茎和一年生茎中内生真菌的丰度最高,分别占菌株总数的27.73%和26.04%;干茎中内生真菌的多样性最高,分离到36个属的445株内生真菌。从不同季节看,秋季分离获得的内生真菌多样性最高,分布于35个属的780株,约为春季分离菌株数量的2倍;且核桃内生真菌在一年中呈现‘秋盛春衰’周期性动态变化的规律。从不同生境看,蓝田的核桃内生真菌多样性最高,分离到45个属的676株内生真菌,山阳的核桃内生真菌丰度最大,分离到1011株内生真菌,占菌株总数的40.68%。(2)通过拮抗试验从176株核桃内生真菌中筛选得到了具有显著抗菌活性的LTL-G3等11个菌株,同时发现辣椒疫霉(Phytophthora capsici)和番茄早疫(Alternaria sonali)两种病原菌更适合作为核桃内生真菌的拮抗活性指示菌。发酵液抑菌试验表明,弯角镰刀菌(Fusarium camptoceras)LTL-G3、木霉属(Trichoderma)YJL-3和德氏霉属(Drechslera)YJL-14菌株的代谢产物中具有值得深入研究的抑菌活性物质;核桃内生真菌代谢产物对番茄早疫病菌和产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens)的抑菌效果最显著。(3)弯角镰刀菌LTL-G3在PDB培养基中,28℃、180 r/min暗培养12 d发酵成熟。用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇对发酵产物进行极性萃取,各相萃取物的质量大小依次为:正丁醇相乙酸乙酯相石油醚相。不同极性的代谢产物萃取物抑菌试验表明,乙酸乙酯相和正丁醇相萃取物的抑菌活性最好;乙酸乙酯相和正丁醇相萃取物的梯度抑菌试验显示,当乙酸乙酯相和正丁醇相萃取物浓度为10 mg/mL时,对苹果腐烂(Valsa ceratosperma)、小麦赤霉(Fusarium graminearum)病原菌的抑制率达到100%。正丁醇相和乙酸乙酯相萃取物对苹果腐烂病的离体防治效果分别为40.74%和33.33%。(4)对LTL-G3发酵产物的代谢组学分析,检测到17个类别的307种化合物,化合物数量最多的物质类别是黄酮类化合物、氨基酸及其衍生物和脂质;相对含量最高的是氨基酸及其衍生物、植物激素和核苷酸及其衍生物;推测LTL-G3菌株发酵代谢产物中的活性物质可能为水杨酸、苦皮藤碱和阿魏酰尸胺。


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