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Arabidopsis thaliana BTR1蛋白的原核表达及理化性质分析

于营  
【摘要】:BTR1蛋白是拟南芥中与番茄花叶病毒(ToMV)基因组RNA相结合的蛋白,能抑制此病毒的扩增。BTR1由334个氨基酸残基组成,其含有三个异构核核糖核蛋白K同源RNA结合结构域(KH domain),KH domain能有序列特异性的与单链核酸结合。BTR1基因产生两个剪接变体mRNA,分别编码不同蛋白产物BTR1L和BTR1S,拟南芥中主要表达的是BTR1S蛋白。BTR1S蛋白的mRNA在拟南芥的叶,茎及果实的组织中都可以表达。ToMV的基因组RNA长度为6384nts,并且具有71nt的5'UTR(非翻译区)和202nt的3'UTR。BTR1S优先并直接结合ToMV基因组RNA的5'UTR。BTR1的敲除和过表达分别导致拟南芥叶中ToMV增殖的增加和减少,但是在原生质体中,这种影响很难被检测到。并且这种影响是特异性的。目前为止,对于BTR1蛋白的研究报道非常少见,关于该蛋白的晶体结构及功能机制并没有报导,并且BTR1蛋白对ToMV扩散的负面影响的基础机制也是未知的。本研究对Arabidopsis thaliana BTR1基因的原核表达载体进行构建,然后进行原核表达,利用层析的方法纯化得到了BTR1蛋白,并对其均一性、聚集状态及与单链核酸的结合活性进行了分析,为进一步研究BTR1蛋白的结构和功能等提供了基本数据。主要获得以下研究结果:1.人工合成经过优化的编码序列Arabidopsis thaliana BTR1基因,构建pET-15b(BE-)SUMO-BTR1表达质粒,转化到E.coli 2566感受态中18℃诱导表达,使用Ni-NTA柱及Superdex 200进行蛋白纯化,得到了纯度大于95%的BTR1蛋白,其分子量约为34kD。2.通过凝胶过滤层析和动态激光散射技术(DLS)对BTR1蛋白的均一性及聚集状态进行了详细全面的分析。结果显示,BTR1蛋白有很好的均一性,在溶液中聚集状态可能为多聚体,而不是单体。3.通过凝胶滞缓实验(EMSA)分析BTR1蛋白与单链核酸的结合活性,结果显示BTR1具有单链DNA和RNA的结合活性,与双链DNA和G4无法结合。4.通过荧光各向异性技术进一步测定BTR1蛋白与单链核酸的结合活性,结果显示与EMSA所测定的结果相一致,BTR1能与单链DNA和RNA相结合。对于相同类型的ssDNA与ssRNA底物,随着链的增长BTR1对其结合活性呈逐渐增强的趋势。BTR1对于序列是随机的ssDNA比序列中含有连续重复碱基的ssDNA的结合活性更强。BTR1与ssRNA的结合活性要强于与ssDNA的结合活性。5.假丝酵母Pif1解旋酶(Capif1)可以在撞击端粒酶之后行使解旋酶功能,然后进行第二轮的延伸,并且发现Capif1具有3’-5’外切活性。将构建成功的重组质粒,转化到E.coli BL21(DE3)感受态中18℃诱导表达,使用Ni-NTA亲核柱、SP阳离子柱及Superdex200进行蛋白纯化,得到了纯度大于95%的Capif1蛋白,其分子量约为79kD。本研究成功构建并表达纯化了高纯度的BTR1蛋白,明晰了其均一性与聚集状态,测定了其与单链核酸结合的活性,为接下来的BTR1晶体制备及结构解析奠定了基础。纯化出纯度大于95%的Capif1蛋白,用于一系列对其活性研究的实验中。


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