新疆库尔勒香梨多倍体诱导和抗寒突变体筛选

【摘要】：新疆库尔勒香梨(Pyrus sinkiangensis Yü)果皮薄、肉质细嫩、香味浓郁,是我国名特优梨品种。但库尔勒香梨果个较小,另外,近年冬季常遇低温冻害,造成了树体大面积死亡。因此,生产上急需在保证库尔勒香梨原有优良品质的前提下提高其抗寒性和果实大小。本研究以库尔勒香梨为材料,建立库尔勒香梨多倍体诱导体系和EMS诱变筛选库尔勒香梨抗寒突变体的体系。主要研究结果如下:1.库尔勒香梨茎段增殖和多倍体诱导以库尔勒香梨茎段为材料,系统地研究了不同浓度细胞分裂素和生长素对茎段增殖的影响。库尔勒香梨茎段增殖的适宜培养基为MS+0.3 mg·L~-11 IBA+1.4 mg·L~-11 6-BA+30g·L~(-1)蔗糖+7 g·L~(-1)琼脂(pH=5.8),增殖系数为2.48。另外,以库尔勒香梨叶片为材料,研究了不同浓度秋水仙素和二甲基亚砜(DMSO)对库尔勒香梨多倍体诱导的影响。结果表明,通过添加二甲基亚砜的方法,可以提高多倍体诱导率,0.2%秋水仙素+2%DMSO组合处理的多倍体诱导效率最高,诱导率为20.00%。2.适宜提取梨细胞核的解离液筛选和库尔勒香梨多倍体的鉴定以二倍体库尔勒香梨叶片为材料,用剪切法提取细胞核,综合分析General Purpose Buffer(GPB)、Woody Plant Buffer(WPB)、Otto’s Buffer(OTTO)、Galbraith's Buffer(Galbraith's)和改良猕猴桃解离液(HEPES)五种解离液制备的悬浮液细胞核形态特征、DNA相对含量和细胞核提取效率。结果表明,GPB和OTTO提取的细胞核悬浮液有较多碎片和杂质,以至于影响流式图峰值的形成,WPB、Galbraith's和HEPES这三种解离液提取的细胞核悬浮液虽然在G0/G1期形成了呈正态分布的、变异系数均小于5%的DNA相对含量直方图,但是这三种解离液中只有WPB和Galbraith's同时在G2/M期也形成了DNA峰;另外,从提取细胞核的效率上来看,Galbraith's解离液提取细胞核的效率高于WPB解离液。本实验筛选Galbraith's解离液为提取梨细胞核的适宜缓冲液。对筛选出的多倍体株系进行流式细胞仪检测,多倍体的荧光吸收通道值(16000)是二倍体荧光吸收通道值(8000)的两倍,表明获得了四倍体库尔勒香梨。以二倍体和四倍体库尔勒香梨为材料,观察分析了形态特征等差异,相比二倍体库尔勒香梨,四倍体库尔勒香梨茎杆粗壮,节间较短。另外,细胞学分析显示,四倍体气孔比二倍体气孔更宽更长。同时也发现,四倍体的气孔密度(155个细胞·mm~(-2))是二倍体气孔密度(77.85个细胞·mm~(-2))的两倍。四倍体库尔勒香梨的叶片较厚于二倍体库尔勒香梨叶片。3.库尔勒香梨抗寒突变体诱导以库尔勒香梨茎段为材料,研究了EMS浓度与处理时间组合对茎段成活率的影响。结果表明,随着处理时间的延长和诱变剂浓度的增加,茎段成活率均表现为下降趋势,经过半致死和临界致死浓度/时间的筛选,诱变剂处理茎段的最佳组合为0.72%-0.8%EMS处理3.0-3.8 h,或者0.48%-0.62%处理5 h。另外,用不同低温(4℃、0℃和-4℃)和EMS半致死浓度同时处理茎段后发现,-4℃处理的茎段均被冻死,而4℃和0℃低温处理的茎段均有新芽萌发。4.低温胁迫处理对再生植株抗寒指标的影响通过分析比较四倍体库尔勒香梨、抗寒突变体株系与二倍体库尔勒香梨之间的差异。结果显示,多倍体和抗寒株系的SOD、POD活性和Pro含量均高于二倍体。对照POD活性为0.27 U·g~(-1)FW,多倍体poly-5株系的POD活性最高,是对照POD活性的4倍。另外,多倍体和抗寒突变体的MDA均显著低于对照。二倍体库尔勒香梨脯氨酸含量为16.14μg·g~(-1)FW。多倍体poly-1株系的脯氨酸含量最高,是对照的7.6倍,poly-1株系的脯氨酸含量是122.56μg·g~(-1)FW。