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拟南芥发育缺陷突变体的筛选、克隆与功能研究

徐金龙  
【摘要】:筛选具有特异发育表型的突变体是开展植物基因功能研究的重要前提。本研究以模式植物拟南芥为材料,筛选获得一系列EMS诱变产生的拟南芥发育缺陷突变体。针对这一系列突变体开展了系统分类和表型描述,并且针对4个突变体开展了突变基因的克隆工作。此外,鉴定拟南芥CDC5基因T-DNA插入功能缺失突变体,并制备CDC5蛋白的多克隆抗体,为进一步研究CDC5基因功能创造了条件。本论文主要取得以下结果:(1)筛选出四类拟南芥发育缺陷突变体:晚开花突变体(3个)、叶色发育缺陷突变体(16个),叶形发育缺陷突变体(12个)和表皮毛发育缺陷突变体(5个),并对以上单基因突变体与野生型拟南芥进行回交以纯化其遗传背景。(2)本研究利用遗传学和分子生物学方法,初步确定了F14-46V、F10-25 No.3、F12-12S以及F14-50中潜在突变基因。其中,F14-46V中VAR2基因发生突变,该基因编码FtsH蛋白复合体的亚基,其主要功能为参与光D1蛋白的降解;F10-25 No.3中EGY1基因发生突变,该基因编码一种不依赖ATP的叶绿体类囊体膜金属蛋白酶,对叶绿体膜中叶绿素和叶绿素a/b结合(CAB)蛋白的积累至关重要;F12-12S中TUB4基因发生突变,该基因编码一种β微管蛋白,与α微管蛋白一起构成细胞骨架;F14-50中KTN1基因发生突变,该基因编码的微管切割蛋白通过调节动态微管变化从而精确控制微管的数量、组装及拆卸速度。通过对以上四种基因编码的蛋白质进行氨基酸序列同源性比对发现,发生突变的氨基酸均十分保守且位于十分保守的结构域中。(3)鉴定拟南芥CDC5基因功能缺失突变体GK_278B09,与野生型主根长度比较发现GK_278B09中CDC5的突变导致植物主根发育受到抑制,且生长速度和长度均低于WT。此外,在大肠杆菌中诱导表达CDC5蛋白N端144个氨基酸,通过亲核层析纯化并免疫家兔,获得针对CDC5的多克隆抗体,该抗体能够有效地检测出100 ng原核表达的CDC5_(1-144)抗原。综上所述,本研究筛选了4大类拟南芥发育缺陷突变体,克隆其中4个突变体的突变基因,并对CDC5 T-DNA插入功能缺失突变体的主根发育异常表型进行统计,制备针对CDC5的多克隆抗体。


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