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枯草芽孢杆菌胞外囊泡的分离及其对巨噬细胞免疫功能的影响

苏源  
【摘要】:细菌胞外囊泡(outer membrane vesicles,OMVs)是在细菌生长过程中从细胞膜分泌到细胞外空间的具有脂质双层结构的纳米级囊泡,它含有细菌细胞膜蛋白,脂质和核酸等多种生物活性分子,在细胞间传递信号,具有多种生理功能。如:介导细菌-宿主相互作用,呈递细菌抗原,调节宿主免疫系统功能。随着对OMV生物学特性和功能研究的不断深入,一些共生细菌和益生菌是否能通过分泌OMVs途径诱导宿主免疫系统的发育已引起学术界的广泛关注。本试验分离纯化枯草芽孢杆菌168菌株(B.subtilis 168)细胞外囊泡,以小鼠巨噬细胞为模型,研究B.subtilis 168细胞外囊泡(BS-OMV)对巨噬细胞活力的影响。并且构建绿色荧光蛋白重组B subtilis 168,检测细胞外囊泡携带重组蛋白的能力。主要试验结果如下:(1)首先采用差速离心法从B.subtilis 168培养液上清中富集BS-OMVs,随后采用密度梯度离心法进行纯化得到纯化BS-OMVs。扫描电镜检测结果显示:BS-OMVs的形态大小不一,视野清晰且无杂质,呈圆形或椭圆形,直径平均约为100 nm左右,范围在50-200 nm之内,符合细菌OMVs颗粒粒径的要求;纳米粒径分析仪检测结果表明MODE曲线线条平缓流利,说明获得的BS-OMVs中含有的其他杂质较少,纯度好,粒径峰值是85 nm,粒径范围为50-200 nm之间,与SEM观察到的细粒径大小值基本吻合。蛋白定量结果显示:1×10~(10) particles/mL的BS-OMVs的蛋白含量为5.1μg/mL。(2)以小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞为体外模型,研究6组不同浓度的BS-OMVs(分别为0、1、2、4、8和16 ug/mL)对细胞存活率、胞内相关酶活及分泌促炎性细胞因子(TNF-α和IL-6)和抗炎性细胞因子(IL-10和TGF-β)的影响。与对照组PBS相比,OMV1、OMV2组的细胞存活率、胞外LDH和细胞内SOD活性没有显著差异,胞内ACP、LDH和iNOS活性显著升高(P0.05),促炎性细胞因子(TNF-α和IL-6)分泌量提高为原来的2-5和3-5倍,OMV4组的细胞存活率,胞外LDH和细胞内SOD活性没有显著差异,胞内ACP、LDH和iNOS活性最高(P0.05),促炎性细胞因子(TNF-α和IL-6)分泌量提高为原来的2-5和3-5倍,抗炎性细胞因子(IL-10和TGF-β)的分泌量显著高于其他组。OMV8、OMV16组的细胞存活率、细胞内LDH和SOD活性显著降低,促炎性细胞因子(TNF-α和IL-6)分泌量提高为原来的9-15倍和10-17倍。(3)将携带含有荧光基因的大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭质粒YGJ32,转化枯草芽孢杆菌168菌株,从重组枯草芽孢杆菌中分离纯化出胞外囊泡,在荧光显微镜下观察重组的枯草芽孢杆菌胞外囊泡,发现其携带荧光。综上,适量BS-OMVs可通过提高巨噬细胞免疫相关酶活,调节细胞因子分泌量以增强其免疫功能。


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