收藏本站
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

纤维素酶系在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及高效协同作用的研究

张炜炜  
【摘要】:近年来,畜牧行业发展迅速,导致饲料资源越来越匮乏,人畜争粮问题越来越严重,饲料资源已成为阻碍养殖业持续健康发展的一个重大问题。然而有一类主要成分为木质纤维素的农作物副产品资源十分丰富,但是这类含有木质纤维素的植物,因其细胞壁难以降解,造成了自然界中大量的纤维素资源没有在畜牧行业中得到广泛应用,甚至造成环境污染。将木质纤维素分解为可以被消化吸收的营养成分,依赖于纤维素酶系对底物的协同降解。本论文围绕产纤维素酶芽孢杆菌的筛选,纤维素酶基因的克隆,枯草芽孢杆菌信号肽的系统性筛选,纤维素内切酶、纤维素外切酶和木聚糖酶的分泌表达,以及多酶协同与多酶复合体协同降解天然纤维素效果进行了研究。结果如下:1采用刚果红染色法从腐殖质中分离获得一株产纤维素酶的芽孢杆菌(Bacillus sp),经革兰氏染色和16s rDNA序列比对分析,分离获得的芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),将其命名为B.subtili ZC-5。B.subtili ZC-5培养24 h产酶活性最高达到3.22U/mL。B.subtili ZC-5的纤维素酶的最适反应温度为50℃-60℃,最适pH为pH6-pH7。该酶不耐受高温。不同纤维来源对B.subtili ZC-5产纤维素酶活力有影响,培养基中添加燕麦青干草时B.subtili ZC-5纤维素酶活最高(4.21U/mL)。2从B.subtili ZC-5基因组DNA中克隆获得纤维素内切酶基因cen ZC-5。cen ZC-5全长1.5 kb,编码55个氨基酸,其编码蛋白的N端30个氨基酸为信号肽。cen ZC-5的序列与Bacillus subtilis纤维素内切酶基因序列的相似性达到94%,cen ZC-5编码蛋白与Bacillus subtilis的纤维素内切酶具有很高的相似性。在大肠杆菌中进行cen ZC-5原核表达,验证了该基因编码蛋白的纤维素酶活性。3构建了E.coli-B.subtilis穿梭质粒载体pCBS。基于pCBS和木聚糖酶基因xynBYG,分别构建获得信号肽筛选载体pP43-xynBYG和pPglvm-xynBYG。从B.subtilis1A747基因组中扩增获得138个信号肽编码基因,获得114个信号肽筛选表达载体pGS-pGS 114、114个信号肽筛选表达载体pP43S1-pP43S114、24个信号肽筛选表达载体pGT1-pGT24和24个信号肽筛选表达载体pP43T1-pP43T24。以B.subtilis WB700为宿主进行276个信号肽介导的分泌表达检测。结果显示,信号肽Sec途径信号肽PhoB、YhfM,YpjP和CotC展现了高分泌表达水平,木聚糖酶酶活高于150 U/mL。含Tat途径信号肽的分泌表达重组菌中,信号肽LipA的酶活最高,大部分Tat途径信号肽的酶活低于0.1 U/mL。4对信号肽的氨基酸残基性质和相应分泌表达量进行分析。结果显示,氨基酸疏水性、螺旋倾向性指数、螺旋含量指数、侧链θ角度指数、螺旋稳定性指数、氨基酸残基跨膜指数、双氨基酸残基转角倾向指数和信号肽D-score等指标和分泌表达量呈强相关性。LPS分析显示,7个氨基酸指数和信号肽D-score对分泌表达量变异的贡献率为23%,其中螺旋倾向性指数,氨基酸残基跨膜指数和D-score是3个重要的独立变量。采用同样的分析方法分析这8个变量(7个氨基酸指数和信号肽D-score)和角质酶分泌表达的关系。结果显示,这8个变量对角质酶分泌表达量变异的贡献率为18%,氨基酸残基跨膜指数和D-score是2个重要的独立变量。PLS预测的模型和木聚糖酶表达量的测定值之间具有强相关性(PCC=0.54)。5构建了含自身信号肽的cen ZC-5分泌表达载体pCEN,phoB介导的cen ZC-5分泌表达载体pPhoB-CEN。合成Clostridium thermocellum多酶复合体中纤维素酶组分的锚定域蛋白(Dockerin)的编码基因Ctdoc,构建3’端嵌合Ctdoccen的重组基因cenZC-5doc,并构建了cenZC-5doc分泌表达载体pCENdoc。分泌表达检测显示,在12h、24h、36h和48h,B.subtilis WB700(pPhoB-CEN)的分泌表达水平依次是WB700(pCEN)的1.56、1.44、1.37和1.25倍。B.subtilis WB700(pCendoc)在24h和36h的分泌表达水平依次是B.subtilis WB700(pPhoB-CEN)的84.68%和8427%。6合成嵌合了Clostridium cellulolyticum纤维素Dockerin的编码基因Ccdoc的重组纤维素外切酶cbhAdoc,并构建分泌表达载体pCBdoc。构建嵌合了Rumincoccus flavefaciens Dockerin的编码基因Rfdoc的重组木聚糖酶xyn BYGdoc,并构建分泌表达载体pXYNdoc。设计合成含Clostridium thermocellum纤维素结合域(CBM)和粘附域(Cohesin),Clostridium cellulolyticum Cohesin和Rumincoccus flavefaciens Cohesin的脚手架蛋白(Scaffoldin)基因scafCCR,并构建分泌表达载体pScaf。分泌表达检测显示,cbhAdoc在B.subtilis WB700中的分泌表达水平在24h达到最大为1.59U/mL。重组木聚糖酶Xyn BYGdoc在24h的分泌表达水平达到最大为302.11U/mL。在24h和48h,重组木聚糖酶(xyn BYGdoc)的分泌表达量为木聚糖酶(xyn BYG)的81.56%和76.24%。7为检测不同酶协同降解效果,采用B.subtilis WB700分泌表达的CenZC-5doc和CbhAdoc共同处理燕麦青干草时,在24h、48h和72h还原糖的产量均高于CenZC-5doc或CbhAdoc单独处理燕麦青干草。采用B.subtilis WB700分泌表达CenZC-5doc、CbhAdoc和Xyn BYGdoc共同降解燕麦青干草2h、48h和72h,还原糖的产量显著的高于CenZC-5doc和CbhAdoc共同降解燕麦青干草的还原糖产量。CenZC-5doc、CbhAdoc和Xyn BYGdoc共同降解24h、48h和72h的还原糖的产量分别是是CenZC-5doc和CbhAdoc双酶共同降解的1.38倍、1.42倍和1.17倍。纯化B.subtilis WB700分泌表达CenZC-5doc,CbhAdoc,Xyn BYGdoc和ScafCCR,在体外孵育组装多酶复合体,多酶复合体降解燕麦青干草产生的还原糖量在24h、48h和72h均高于CenZC-5doc、CbhAdoc和Xyn BYGdoc的3酶混合物共同降解产生的还原糖量。


知网文化
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前20条
1 王海军;王艳芳;江莺;赵文杰;任艳;马吉胜;;人bFGF卵清蛋白分泌表达载体的构建及分析[J];黑龙江医药;2010年03期
2 龙建银,王会信,刘莉;人转化生长因子β1在大肠杆菌中的分泌表达研究[J];生物技术通讯;1997年Z1期
3 吴宗华;胡波;李朝霞;祝中一;;利用大肠埃希菌分泌表达乙型肝炎病毒核心抗原[J];中国卫生检验杂志;2011年07期
4 夏雨;成玉梁;李达倩;吕源玲;;枯草芽孢杆菌分泌载体构建及其对脂肪酶A的分泌表达[J];安徽农业科学;2011年30期
5 朱向东;徐波;;乳酸菌蛋白质分泌表达研究进展[J];中国微生态学杂志;2008年01期
6 赵颖怡,梁世中,黄鲲,黄日波;一种新型酿酒酵母附加型分泌表达载体的构建[J];微生物学报;2002年04期
7 张欢欢;陈昶旭;刘中美;周哲敏;;雅致放射毛霉羧肽酶Y在毕赤酵母中高效分泌表达[J];食品与发酵工业;年期
8 孙明军,赵晨,沙金,韩海棠,郑克俭,李赞东;鸡输卵管组织特异性分泌表达载体的构建和表达[J];农业生物技术学报;2003年01期
9 龙建银,王会信,刘莉,王芳,周廷冲;人转化生长因子β1在大肠杆菌中的分泌表达[J];中国生物化学与分子生物学报;1999年02期
10 李晓栋;赵香君;霍闻钧;黄湘;乔亚峰;;pSecTag2A-HBV-L真核分泌表达载体的构建及表达[J];医学信息(上旬刊);2010年09期
11 马红丹;张丽媛;赵邯郸;徐丹丹;曲静;关淑艳;王丕武;;大豆锰超氧化物歧化酶基因在乳酸乳球菌中的分泌表达[J];食品科学;2015年01期
12 郁川;翟崇凯;廖成水;余祖华;何雷;贾艳艳;李静;张春杰;程相朝;;减毒鼠伤寒沙门菌三型分泌表达系统的构建及其特性[J];生物工程学报;2016年12期
13 毛晓华,丁蕾,李震,缪峰,张鉴堂;胶质细胞源性神经营养因子在链霉菌的分泌表达[J];东南大学学报(医学版);2002年04期
14 熊志红,逯好英,王嘉玺;人白介素6基因在酵母中的高效分泌表达[J];军事医学科学院院刊;1997年04期
15 韦宇拓,汪嵘,杜丽琴,陆坚,黄鲲,黄日波;合成耐高温α-淀粉酶基因在巴斯德毕赤酵母中的分泌表达[J];中国生物工程杂志;2005年01期
16 杨立宏,韩丽英,苏成芝,高长寿;人白细胞介素-3基因在酿酒酵母中的分泌表达[J];生物工程学报;1996年02期
17 刘永亮,童克忠;利用枯草杆菌碱性蛋白酶E基因的信号顺序构建分泌表达载体[J];遗传学报;1994年03期
18 杨青;汪斌;王亚伟;张华山;熊海容;张莉;;介导两种半纤维素酶分泌表达的信号肽比较[J];中国生物工程杂志;2017年08期
19 张树军;杨磊;黄瑾;;信号肽序列在酵母分泌表达系统中的应用[J];医学综述;2007年09期
20 段聚宝,蔡欣,王嘉玺,周俐梅;硫氧还蛋白在毕赤酵母中的分泌表达[J];军事医学科学院院刊;1998年01期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
1 郭虹;史江;盛民立;;重组人TPO生物学效应研究[A];中国细胞生物学学会第七次会议论文摘要汇编[C];1999年
2 陆信曜;刘松;张东旭;堵国成;陈坚;;细菌脂肪氧合酶在大肠杆菌中的分泌表达[A];第八届中国酶工程学术研讨会论文集[C];2011年
3 赵秋伟;余志良;周政;蔡瑞;袁中一;;不同表达元件对青霉素G酰化酶在枯草芽孢杆菌中分泌表达的影响[A];第四届中国酶工程学术交流讨论会论文集[C];2003年
4 代晓华;朱惠芳;熊冬生;周圆;;人Survivin蛋白克隆、原核分泌表达与纯化[A];天津市生物医学工程学会第三十二届学术年会论文集[C];2012年
5 林洪羽;能昌爱;徐建;王利月;仲飞;李秀锦;;人类CD14信号肽介导卵清蛋白基因在真核细胞的高效分泌表达[A];全国动物生理生化第七届全国代表大会暨第十三次学术交流会论文摘要汇编[C];2014年
6 孔宁;周余来;王毅;宿晓云;王芳;丛中一;苏曼曼;侯宜;颜炜群;;重组人抑瘤素M的表达、纯化及鉴定[A];2010施慧达杯第十届全国青年药学工作者最新科研成果交流会论文集[C];2010年
7 王富强;周兴军;王彦芳;田雪虹;张谦;贺秉坤;;hG-CSF大肠杆菌分泌表达系统的构建[A];中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集[C];2001年
8 邹根;江艳萍;陈玲;刘睿;王成树;周志华;;里氏木霉表达系统构建和优化[A];中国菌物学会第六届会员代表大会(2014年学术年会)暨贵州省食用菌产业发展高峰论坛会议摘要[C];2014年
9 金俊琰;周莉;赵久刚;桂建芳;;石斑鱼防御素BD2基因在毕赤酵母中的分泌表达及纯化[A];湖北省遗传学会、江西省遗传学会2006年学术年会暨学术讨论会论文摘要集[C];2006年
10 能昌爱;李秀锦;仲飞;李振;张峰;;D14信号肽序列介导卵清蛋白(OVA)基因在HEK293T细胞中的分泌表达[A];全国动物生理生化第十二次学术交流会论文摘要汇编[C];2012年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 张炜炜;纤维素酶系在枯草芽孢杆菌中的分泌表达及高效协同作用的研究[D];西北农林科技大学;2018年
2 徐军;抗冻肽表达载体构建与应用、绿色木霉分泌表达系统及AFP基因内含子功能的研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2004年
3 洪斌;鲑鱼降钙素在链霉菌中的分泌表达[D];中国协和医科大学;1996年
4 杨宇;神经保护短肽体内分泌表达策略和治疗作用的研究[D];吉林大学;2007年
5 周绪霞;Apidaecin功能基团和作用靶位点分析及其在乳酸乳球菌中的分泌表达[D];浙江大学;2008年
6 闻崇炜;活性多肽的分泌表达研究[D];中国科学院研究生院(上海生命科学研究院);2003年
7 田园;猪IFN-γ在毕赤酵母中分泌表达及大规模发酵条件的研究[D];吉林大学;2010年
8 战荣荣;不同启动子调控的菊糖果糖转移酶在毕赤酵母中的高效分泌表达[D];江南大学;2014年
9 关成冉;枯草芽孢杆菌及链霉菌表达系统的构建及应用研究[D];江南大学;2016年
10 高新星;枯草芽孢杆菌氨肽酶分泌表达、分子改造及生理功能研究[D];江南大学;2014年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 娄颖;重组人源甲状腺过氧化物酶的分泌表达及扩大培养[D];华东理工大学;2018年
2 高昇;EG基因在大肠杆菌中的表达及BG基因在乳酸菌中的共分泌表达[D];甘肃农业大学;2018年
3 孙欣;细胞内非分泌表达淀粉样蛋白Aβ_(1-42)所致细胞毒作用的研究[D];吉林大学;2006年
4 刘艺婷;淀粉分支酶在大肠杆菌中的分泌表达及其分子改造研究[D];江南大学;2017年
5 王延群;牛α干扰素在毕赤酵母中的高效分泌表达及活性研究[D];中国农业科学院;2013年
6 李英华;鲤鱼生长激素 cDNA在毕赤酵母中的胞内表达和分泌表达[D];暨南大学;2001年
7 南志春;性腺激素对山羊子宫内膜细胞IL-18分泌表达的影响[D];西北农林科技大学;2012年
8 李雁飞;多功能淀粉酶OPMA在枯草杆菌中的分泌表达与性质研究[D];吉林大学;2010年
9 何正祥;重组人生长激素在大肠杆菌中分泌表达及其纯化的研究[D];安徽大学;2006年
10 朱丽;甜蛋白Brazzein在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达[D];山西农业大学;2004年
中国重要报纸全文数据库 前2条
1 程洪远;垦中“立体化育人”凸显“立体”[N];海南农垦报;2009年
2 记者 曾亮亮;21世纪是肽治疗世纪[N];经济参考报;2013年
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62982499
  • 010-62783978