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黄瓜高效遗传转化体系的建立和嫩果白皮基因w的图位克隆与功能分析

刘汉强  
【摘要】:遗传转化验证是研究基因功能的重要手段,是现代分子育种的重要途径。自1986年首次报道黄瓜转基因的数十年以来,已有大量科研人员致力于黄瓜转基因体系的开发和改良。但是已报道的黄瓜遗传转化效率差异较大,转化体系不稳定,缺乏试验细节,制约着黄瓜基因功能研究与分子育种,因此急需开发稳定、可靠、广适性的黄瓜遗传转化体系。嫩果果皮颜色是黄瓜重要的外观品质,是影响消费者消费选择的重要因素。白皮黄瓜作为传统特色黄瓜之一,目前在我国各地作为特色黄瓜相继引种发展,但黄瓜嫩果皮性状的调控基因及调控机理尚不明确,制约白皮黄瓜的分子设计育种。本研究从现有遗传转化体系着手,通过优化转化体系中的多个参数,建立黄瓜高效遗传转化体系。利用经典图位克隆技术定位和克隆白色嫩果皮调控基因w,并对其功能进行验证。研究取得以下主要成果:(1)黄瓜高效遗传转化体系的建立以美国切片黄瓜Poinsett76为试材,构建pCAMBIA2301-LL超表达载体,使用农杆菌菌株AGL1进行介导,通过超表达调控黄瓜叶片大小基因LITTLE LEAF(LL)建立黄瓜的遗传转化体系。试验发现,种子在28℃下催芽2d后,靠近顶端生长点处1/3-1/2的子叶部分是较为理想的外植体,切口处避免残留顶端分生组织。AGL1侵染液的最适浓度(OD_(600))为0.7-0.8。农杆菌与外植体在23℃条件下共培养2天可以比28℃诱导出更多的不定芽。共培养结束后挑取外观为黄绿色的外植体进行分化培养,最佳分化培养基配方为MS+0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L ABA,用卡那霉素筛选阳性不定芽的最适浓度为100 mg/L。不定芽经继代培养一次可显著提高转基因阳性率。转基因植株在T0代即可看到叶片比野生型明显变大。本遗传转化体系的平均转化效率为0.5%。(2)黄瓜嫩果白色果皮调控基因w的精细定位用绿皮黄瓜Q30、WD3和白皮黄瓜Q24、B-2-2构建Q30×Q24和WD3×B-2-2两个杂交组合,分析6世代遗传群体果皮颜色的分离比例,推测黄瓜嫩果白色果皮性状由单核隐性基因(w)控制,绿色显性于白色。用SSR和InDel标记对Q30×Q24的2971株F_2单株进行基因分型,经连锁分析与图谱构建,将w基因定位在3号染色体33.0 kb范围内,含4个候选基因,其中基因peroxidase superfamily protein(PSP)和Arabidopsis two-component response regulator-like(APRR2)的表达量及氨基酸序列在双亲间存在差异。为进一步确定w基因的候选基因,本研究将F_2定位群体扩大至9497株,依据双亲全基因组序列数据进一步开发InDel和SNP标记,最终将w基因定位在3号染色体8.2 kb范围内,只包含一个候选基因APRR2。(3)APRR2基因的克隆与功能初步分析以黄瓜材料9930中APRR2的cDNA序列为模板设计克隆引物,扩增得到Q30与Q24中APRR2基因的cDNA序列全长分别为1566bp和1567bp,均含12个外显子,Q24在第9个外显子末端有一个单核苷酸(G)的插入。对其他4个绿皮和4个白皮材料的的APRR2编码序列进行测序,发现所有白皮材料相对绿皮材料都有该核苷酸的插入。利用NCBI ORF Finder预测该基因的氨基酸序列,发现该G碱基的插入导致等位基因aprr2在白皮黄瓜材料中发生移码突变,使翻译提前终止,相对绿色材料缺失了末端的101个氨基酸。作为与植物成熟相关的转录因子,试验发现APRR2的表达量随着Q30果实的成熟呈现先升高后降低的趋势,且各个时期的表达量均高于Q24。光学显微观察发现Q30果皮中叶绿素含量、叶绿体的数量及叶绿体的绿色程度均显著高于Q24。亚显微结构观察进一步发现Q30叶绿体中的类囊体结构平整,堆叠有序、致密,基粒数目较多,且排列规则,而Q24的叶绿体类囊体呈现扭曲状,堆叠松散,基粒数目较少,排列不规则,说明Q24的白皮性状可能是由于APRR2发生突变后,导致叶绿体发育不正常,叶绿素不能正常合成所致。(4)APRR2基因功能的遗传转化验证依照超表达LL基因所建立的黄瓜高效遗传转化体系,构建APRR2基因的RNA干扰载体,通过干扰Poinsett76中APRR2基因的表达,从获得的10株PCR阳性幼苗中,发现有2株转基因植株的果皮颜色由深绿色被干扰成浅绿色,证明APRR2基因可以调控绿色果皮的形成。本研究建立了一个稳定、高效的黄瓜遗传转化体系。通过正向和反向遗传学方法克隆和验证了白色嫩果果皮基因APRR2,丰富和发展了黄瓜皮色遗传理论,为黄瓜皮色育种提供了可直接利用的分子标记和基因。


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