打孔基质支架和BMSCs组织工程半月板的构建及其移植效果研究

【摘要】：半月板撕裂是一种最常见的膝关节损伤。虽然外科手术方法可以缝合修复撕裂的半月板,但其仅在外周的血管区域有效并且通常有30%几率发生再撕裂。部分或全部半月板切除术短时间内能减缓关节疼痛和改善功能,但会增加关节软骨的压力,导致软骨退变、骨关节炎和膝关节不稳定。半月板组织工程旨在再生受损组织,为修复半月板损伤提供了可行的解决方案。其中,支架是组织工程的一大要素。半月板脱细胞基质保留了生物化学组成、生物活性和三维结构,具有与天然半月板相当的生物力学性质,且免疫原性低、有再生潜力,是构建组织工程半月板的一种理想支架。可是半月板内紧密排列的胶原纤维网络结构使其基质密度过高,显示出较低的孔隙率,限制了损伤处细胞的增殖、迁移和基质重塑。无论是外源接种的种子细胞还是关节腔内邻近的滑膜细胞都无法渗入支架内部,进而再分布合成必要的细胞外基质,长期来看不具有重塑和维持组织稳态的能力。因此,本试验首先对天然半月板以垂直于下表面方向穿透全层进行均匀打孔,然后通过反复冻融、SDS洗涤和超声波清洗等步骤进行脱细胞处理以制备基质支架,通过DNA定量试验和组织学染色确认脱细胞效果,并检测打孔对脱细胞处理时间的影响以及打孔后支架的孔隙率与力学性能变化;在打孔支架上复合BMSCs共培养,通过细胞增殖试验、扫描电镜观察、糖胺聚糖定量试验和Ⅱ型胶原蛋白western blot试验检测干细胞在打孔支架上粘附增殖和向软骨分化的基质分泌情况;最后将负载BMSCs的打孔基质支架体外诱导培养4周后植入半月板缺损模型犬的膝关节内,术后12周通过临床观察、Lysholm评分、解剖观察、半月板移植物宽度回缩率检测、半月板移植物的组织学与免疫组织化学观察以及股骨髁与胫骨平台软骨的组织学观察来评估组织工程化半月板构建体对膝关节功能的恢复效果和对关节软骨的保护作用。研究结果如下:1.脱细胞后打孔支架的DNA含量显著降低,组织学观察可见良好的胶原纤维结构,未见到细胞核;打孔组支架的脱细胞时间较未打孔的对照组显著缩短;打孔后支架孔隙率显著增大且压缩弹性模量无显著变化;BMSCs在打孔组支架上的增殖与粘附数显著高于对照组;负载BMSCs的打孔支架内的GAG含量和Ⅱ型胶原蛋白表达量随体外培养时间增加均呈上升趋势且高于对照组。2.在半月板缺损模型犬的膝关节中植入构建的组织工程化半月板移植物,术后12周试验犬运动恢复情况良好,Lysholm评分与假手术组无显著差异;膝关节解剖学观察可见股骨髁和胫骨平台软骨表面有轻微磨损,但明显优于切除组。半月板移植物表面有新鲜纤维软骨生成,打孔组较对照组回缩程度小;半月板移植物的组织学和免疫组织化学染色观察,可见打孔组较对照组有更多的细胞浸润和基质分泌。股骨髁和胫骨平台软骨的组织学观察可见打孔组与对照组的软骨表面仍保持一定的完整性,显示出对软骨的保护作用。综上所述,本研究表明了打孔法可以增加半月板脱细胞基质支架的孔隙率并且保持良好的生物力学性能,同时在体外复合BMSCs时可提高支架上细胞的粘附和基质分泌。使用负载BMSCs的打孔脱细胞基质支架体外重塑的组织工程化半月板移植物对修复半月板损伤、保护关节软骨和恢复膝关节功能有积极作用。