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果生炭疽菌效应蛋白CfCE92功能及互作靶标筛选

张凇  
【摘要】:果生炭疽菌严重危害多种经济作物。引起金冠系苹果品种炭疽叶枯病(GLS),造成早期落叶和果实斑点,严重影响苹果产量和品质。已知炭疽菌效应蛋白可以通过影响寄主免疫反应促进寄主感病,为炭疽菌重要致病因子。但目前对果生炭疽菌致病机理目前了解很少。实验室前期从果生炭疽菌筛选鉴定出一个效应蛋白Cf CE92,本研究拟对其致病中的功能进行系统研究,取得以下主要结果:1. 用果生炭疽菌野生型和ΔCf CE92突变体分别接种嘎啦叶片,24 h后提取RNA,进行转录组测序、基因预测与注释,共获得52.41G数据,注释45116个基因。差异分析获得突变体和野生型2370个差异表达基因,其中显著上调310个基因。通过Pathway富集分析可以看出,在乙醛酸和二羧酸代谢途径、黄酮生物合成途径、半乳糖代谢途径、氨基糖和核苷酸糖代谢、甘油脂代谢和MAPK信号转导等6个通路显著富集。2. MAPK信号通路在生物体内能够介导细胞的生长发育及分裂分化等多种生理变化,并参与病理过程。在MAPK信号通路中富集到了7个基因,包括2个脱落酸受体、PR1a、PR3、丝氨酸苏氨酸蛋白激酶、类乙烯反应转录因子和WRKY29。对PR1a、PR3、WRKY29进行了q RT-PCR分析,结果表明突变体比野生型的基因表达水平均显著上调。3. 黄酮类化合物是植物体内重要次生代谢产物,在植物防御中具有重要作用。在黄酮生物合成途径中富集到3个基因:查尔酮合酶、查尔酮异构酶、类莽草酸邻羟基肉桂酰转移酶,q RT-PCR分析显示ΔCf CE92比野生型的表达水平均显著上调。4. 代谢组分析2’,3,4,4’,6’-五羟基查耳酮、7,4’-二羟基黄酮、甘草素、柚皮素、根皮素、根皮苷和乔松素等7种黄酮类化合物显著上调。体外验证显示,7种化合物在PDA培养基中对果生炭疽菌的生长均具有抑制效果,结果表明五羟基查尔酮(EC_(50=)36.6 mg/L)抑制作用最高,柚皮素(143.4 mg/L)与7,4’-二羟基黄酮(150.9 mg/L)抑制作用次之。这些结果表明Cf CE92在侵染过程中可以通过抑制防御相关通路基因的表达抑制抗菌代谢产物的合成。5. 效应蛋白Cf CE92互作靶标筛选:烟草瞬时表达Cf CE92,结果显示Cf CE92定位于烟草细胞质和细胞核。用酵母双杂交技术在果生炭疽菌侵染叶片c DNA文库中进行靶标蛋白筛选,得到68个候选靶标蛋白。利用酵母体内验证显示核苷二磷酸蛋白激酶(NDPK)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)、亮氨酸拉链蛋白(GILZ)在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上生长且变蓝。进一步运用双分子荧光技术(BIFC)显示Cf CE92与NDPK可以在细胞核中共表达。这些结果表明,Cf CE92与植物防卫反应相关基因NDPK存在直接互作关系。本研究表明Cf CE92在侵染过程中可以通过抑制防御相关通路基因的表达,进而抑制病程相关蛋白及抗菌产生代谢产物的合成。筛选到与果生炭疽菌效应蛋白Cf CE92互作的宿主靶标蛋白NDPK。推测Cf CE92通过与NDPK互作抑制寄主防卫反应促进其致病。本研究初步揭示了效应蛋白Cf CE92的致病机理,为进一步探究果生炭疽菌致病机制奠定基础,也为开发新农药提供了靶标。


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