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二穗短柄草—锈菌互作中WRKY转录因子的鉴定及功能分析

王建锋  
【摘要】:小麦条锈病是影响我国小麦安全生产的重大病害之一。条锈菌致病性频繁变异,导致品种抗锈性不断“丧失”,常常引发病害流行,造成巨大损失。因而,开展小麦抗条锈机理研究,寻找条锈病可持续控制新策略,对条锈病可持续控制具有重要意义。WRKY作为一类超级家族转录因子,在调控植物防卫反应基因的表达,从而抵御病原菌中发挥重要作用。然而,参与小麦抗条锈病过程的关键WRKY转录因子及其转录调控机制并不明确。由于小麦基因组庞大、遗传转化效率低,不利于抗锈基因的功能验证及其完整的遗传特性研究。因而,选择和利用模式植物研究锈菌与其抗病互作的分子机理,对深入快速揭示小麦抗条锈机理意义重大。为此,本研究以建立的二穗短柄草和及其锈菌互作体系为对象,系统研究短柄草锈菌侵染二穗短柄草的组织学特征,解析二穗短柄草与其锈菌互作过程的基因表达特征,筛选受短柄草锈菌诱导的BdWRKY转录因子,通过RNAi技术沉默候选转录因子,通过表型及组织学观察短柄草锈菌接种沉默突变体后病菌侵染及寄主应答情况,分析目标基因的功能。本研究对揭示Bd21-3对短柄草锈菌的作用机制,挖掘小麦持久抗病新机制提供重要的理论依据和技术支撑。本研究的主要内容和结果如下:1. 明确了短柄草锈菌(Puccinia brachypodii)在二穗短柄草Bd21-3的叶片中的侵染过程。短柄草锈菌(F-CO、H-KI)接种短柄草自交系Bd21-3后,在12 h时,2种病原菌通过萌发的芽管侵入短柄草气孔,并形成气孔下囊(SV),产生初生菌丝从而形成吸器母细胞(HMC);在接种后18 h时,吸器母细胞侵入植物细胞形成吸器。24 h后,病原菌初生菌丝(IH)开始产生分支,即形成次生菌丝。接种48 h后,病原菌产生了更多的分支。接种后72 h,短柄草锈菌的次生菌丝(SH)进一步发育形成少量菌落。接种后120h,短柄草锈菌形成大量菌落。不同菌系间,F-CO的发育过程要快于H-KI,从而造成在120-216 h时,F-CO的菌落扩展面积明显高于H-KI。2种病原菌的吸器母细胞数和吸器数在病原菌的发育初期没有明显的差别。短柄草锈菌侵染二穗短柄草初期形成的胞间菌丝数、吸器母细胞数、吸器数明显多于小麦条锈菌侵染小麦(亲和组合)时的各种病原菌结构。应用DAB组织化学的染色方法,对短柄草锈菌侵染植物的不同组合中H_2O_2积累进行了检测。通过本研究证实F-CO、H-Ki和二穗短柄草均为亲和互作,不会产生H_2O_2。2. 明确了二穗短柄草WRKY转录因子的功能。通过q RT-PCR对BdWRKY31、BdWRKY36、BdWRKY38、BdWRKY60、BdWRKY62、BdWRKY68和BdWRKY78等7个WRKY TFs基因在二穗短柄草接种F-CO和H-KI后的表达谱进行了分析。在接种F-CO、H-KI后,7个WRKY TFs基因在接种24 h-72 h这个时间段,表达量均上调,表明其参与了短柄草与其锈菌互作的过程。7个基因编码的蛋白具有WRKY转录因子家族典型的WRKY结构域和锌指结构。它们与禾本科植物的转录因子的亲缘关系较近。克隆获得了BdWRKY31、BdWRKY38、BdWRKY60、BdWRKY68、BdWRKY78等5个基因的c DNA全长。利用亚细胞定位的方法,发现这5个基因均定位到植物的细胞核中。初步证实,这5个基因是在植物细胞核中与靶标基因结合,从而调控短柄草的抗/感病过程。3. 本研究利用农杆菌介导的二穗短柄草的遗传转化体系,成功获得了7个BdWRKY TFs的转基因植株。获得的可育转基因植株数量在3-48个株系之间,平均转化效率为36%。经检测,初步证实分别获得BdWRKY31、BdWRKY32、BdWRKY38、BdWRKY60、BdWRKY62、BdWRKY68和BdWRKY78的RNAi突变体6、3、10、1、20、21和12株。4. 结合本研究建立的短柄草锈病10级分类系统,对检测阳性的突变体T3代家系进行表型鉴定,各个基因的突变体植株的反应型见本文表4-8。突变体BdWRKY31R-4、38R-6和60R-2的沉默效率分别为89%、73%和50%。对BdWRKY31R-4、BdWRKY38R-6 和BdWRKY38R-6等3个株系接种F-CO后,其反应型均为中抗,表明分别在短柄草中沉默BdWRKY31、BdWRKY38和BdWRKY60基因,增强了短柄草对F-CO抗性。因此,我们推测BdWRKY31、BdWRKY38和BdWRKY60在短柄草感短柄草锈F-CO过程中起负调控作用。


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