中国野生毛葡萄芪合酶基因VqSTS11和VqSTS23调控抗白粉病菌的研究

【摘要】：葡萄是世界性重要的经济类果树之一,生产上主栽品种是欧洲葡萄,其优点果实品质优良,产量高,但是缺点是抗病性较差,尤其不抗葡萄白粉病[Uncinula necator(Schw.)Burr]。中国是野生葡萄的起源地之一,蕴藏着丰富的抗病基因。课题组前期的研究表明,中国野生毛葡萄‘丹凤-2’不仅有较强的抗病性,而且果实的白藜芦醇含量高;白藜芦醇是芪合酶基因(STS)的表达产物。研究表明葡萄体内芪合酶基因的表达产物不仅有抗病性作用,而且果实中的白藜芦醇对人体健康有益。因此,本文研究中国野生毛葡萄(Vitis quinquangularis)‘丹凤-2’芪合酶基因Vq STS11和Vq STS23的表达与抗病性,利用农杆菌介导Vq STS11和Vq STS23转化了欧洲葡萄无核白,获得转基因株系,对转基因株系进行人工接种白粉病菌,研究对白粉病的抗性,取得主要结果有:1、在中国野生毛葡萄‘丹凤-2’叶片上接种白粉菌后发现,芪合酶基因Vq STS11和Vq STS23的表达上调,并在接种后24h表达量最高值。利用同源克隆获得中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合酶基因Vq STS11和Vq STS23的开放阅读框,基因序列长度为1179bp,编码392个氨基酸,与欧洲葡萄黑比诺的基因组序列比对,发现同源基因分别是Vv STS1和Vv STS5,定位于16号染色体。亚细胞定位结果表明,Vq STS11和Vq STS23蛋白定位于细胞质中。2、以无核白、红地球、赤霞珠的组培苗顶芽为材料,使用器官发生方式诱导葡萄愈伤组织。利用农杆菌介导方法,将外源芪合酶基因Vq STS11和Vq STS23转入欧洲葡萄无核白,通过PCR检测以及Western blot鉴定,获得了5株转Vq STS11基因的无核白植株,以及3株转Vq STS23基因的无核白植株。转基因植株的实时定量PCR分析表明,转基因株系中芪合成酶(STS)基因以及下游糖基转移酶(RSGT)基因表达量较野生型植株升高,而与STS存在底物竞争关系的查尔酮合成酶(CHS)表达量降低。3、通过转基因植株和野生型植株的白粉菌接种用以分析转基因植株的抗病性。结果发现,与野生型植株相比,转基因植株中白粉菌菌丝生长速度较慢,孢子萌发受到一定的抑制。接种后,使用实时定量PCR分析Vq STS11和Vq STS23基因的表达后发现,与同时期的野生型植株相比,芪合酶基因在转基因植株中的相对表达量增加。同时,利用高效液相色谱(HPLC)检测到转基因植株中芪类物质的含量积累增多,其中主要物质为云杉新苷。可以说明与野生型植株相比,转基因植株对白粉病具有抗性。4、对转基因植株和野生型植株进行激素(水杨酸、茉莉酸甲酯、乙烯和脱落酸)和非生物胁迫(盐胁迫、低温、紫外和创伤)处理,结果显示,转基因植株均响应各个处理,并表现出不同程度的上调表达。其中,转Vq STS11基因的转基因植株对Me JA处理最敏感,转Vq STS23基因的转基因植株对Ethylene处理响应最明显。综上,中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合酶基因Vq STS11和Vq STS23及其转化的无核白葡萄株系,在人工接种白粉病菌条件下,较未转基因的野生型无核白葡萄植株,提高了葡萄体内芪合酶基因表达量,表现了对葡萄白粉病具有一定的抗性。因此,中国野生毛葡萄‘丹凤-2’芪合酶基因Vq STS11和Vq STS23对抗白粉菌具有抗性,本研究为利用芪合酶基因与中国野生葡萄资源的抗病育种提供了依据,为抗病新品种育种提供育种资源。