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PRRSV临床毒株的分离鉴定及鲎素抗PRRSV感染的作用

房军洋  
【摘要】:猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗称蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)感染引起的一种以繁殖障碍和呼吸道感染为主要症状的传染病,严重危害猪业。PRRSV是一种易突变的RNA病毒,具有基因多样性,临床上常出现继发感染与混合感染。PRRSV被鉴定至今已有30余年,至今无有效的防控措施,制约了养殖业的经济效益。鲎素(Tachyplesin)是一种从东方鲎(Tachypleus tridentatus Leach)分离提取出来的2.3 kDa的阳离子抗菌肽(Antimicrobial peptide),由17个氨基酸组成,是天然防御系统的重要组成部分。鲎素除了具有抗细菌、真菌作用,还具有抗病毒作用。研究发现,鲎素对水泡性口炎病毒、甲型H1N1流感病毒、呼肠孤病毒、脊髓灰质炎病毒和神经坏死病毒具有抑制作用。鉴于PRRSV变异性强,对疑似PRRSV感染的样品进行病毒分离、鉴定,其中ORF5基因变异较大,根据ORF5的序列情况将北美洲型PRRSV分为四个谱系,因此可以针对ORF5来分析PRRSV遗传变异情况,探求该地猪繁殖与呼吸综合征流行特点及抗原变异规律。同时为研究鲎素对PRRSV感染的影响,以CRL2843~(CD163)细胞和原代PAMs作为体外模型,采用Western blot和病毒滴度测定的方法,探讨鲎素对HP-PRRSV和临床分离毒株感染的影响,主要试验结果如下:1.PRRSV临床毒株的分离鉴定:对疑似PRRSV感染的7份临床样品进行ORF7基因检测,用其中一份阳性样品接种Marc-145细胞和PAMs,将分离得到的毒株命名为SD-LY并进行ORF5基因序列测定和遗传进化分析。试验结果表明:本试验分离毒株SD-LY与BJ-4毒株亲缘关系更近,同源性96.0%,根据进化树分析SD-LY属于lineage5。2.鲎素细胞毒性的测定:使用CCK-8试剂盒评价鲎素对CRL2843~(CD163)细胞和PAMs的细胞毒性。试验结果表明:鲎素浓度在0~75 ng/mL无细胞毒性,当浓度为100ng/mL时会产生细胞毒性。3.鲎素对PRRSV复制的影响:CRL2843~(CD163)细胞和PAMs分别接种PRRSV GD-HD毒株后,与鲎素孵育。试验结果表明:与对照组相比,当鲎素浓度为25 ng/mL时,PRRSV N蛋白的表达水平、子代病毒滴度无显著变化,当鲎素浓度为50 ng/mL和75 ng/mL时,PRRSV N蛋白的表达水平、子代病毒滴度显著降低,呈浓度依赖性。4.鲎素对PRRSV感染活性的影响:PRRSV GD-HD毒株与鲎素共孵育后,将混合物与CRL2843~(CD163)细胞或PAMs共孵育。试验结果表明:与对照组相比,鲎素浓度为25 ng/mL、50 ng/mL、75 ng/mL时,PRRSV N蛋白的表达水平、子代病毒滴度都显著降低,呈浓度依赖性。5.鲎素对PRRSV易感细胞的易感性影响:鲎素与CRL2843~(CD163)细胞或PAMs共孵育后,接种PRRSV GD-HD毒株。试验结果表明:当鲎素浓度为25 ng/mL、50 ng/mL、75 ng/mL时,PRRSV N蛋白的表达水平、子代病毒滴度都无显著变化。6.鲎素对PRRSV临床分离株复制的影响:CRL2843~(CD163)细胞接种PRRSV SD-LY毒株后,与不同浓度的鲎素孵育。试验结果表明:鲎素浓度为25 ng/mL、50 ng/mL、75 ng/mL时,PRRSV N蛋白的表达水平、子代病毒滴度都显著降低,呈浓度依赖性。综上所述,本研究分离鉴定得到一株PRRSV临床毒株并将其命名为SD-LY,根据ORF5序列对比分析、鉴定SD-LY属于lineage 5谱系。鲎素呈浓度依赖性地抑制PRRSV在CRL2843~(CD163)细胞或PAMs中复制,主要是通过抑制病毒的感染活性抑制PRRSV在细胞中的复制,为鲎素作为抗PRRSV治疗药物的研发奠定了理论和试验基础。


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