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中国野生葡萄白粉病抗性遗传规律及VpsCDPKs抗病分子机制研究

胡洋  
【摘要】:葡萄是世界性果树,具有重要经济价值。生产上广泛栽培的欧洲葡萄(Vitis vinifera)易感多种病害,尤其是白粉病。目前主要采用化学防治法防治葡萄病害,虽然效果好,但对生态环境和人体健康危害较大。相比而言,利用野生种葡萄的抗病基因改良欧洲葡萄的抗病性会更加安全与高效。我国拥有丰富的野生葡萄抗病资源。然而,关于中国野生葡萄白粉病抗性的细胞学特征与遗传规律等问题,尚未有明确结论。此外,最新研究表明,植物细胞质外体空间Ca~(2+)内流产生钙信号与抗病蛋白发挥功能密切相关。作为植物的一类钙信号解码蛋白,钙依赖蛋白激酶(Calcium-Dependent Protein Kinases,CDPKs)是否在葡萄与葡萄白粉菌(Erysiphe necator)互作过程中发挥调控作用,目前尚不清楚。本研究以葡萄白粉菌生理小种En.NAFU1为病原菌,观察了14个野生葡萄株系与四个转化RPW8.2(拟南芥抗病基因)的‘无核白’葡萄株系叶片白粉病抗性的细胞学特征,分析了中国野生少毛复叶葡萄(V.piasezkii var.pagnucii)‘白水-40’叶片白粉病抗性的遗传规律,研究了中国野生华东葡萄(V.pseudoreticulata)‘白河-35-1’中两个VpsCDPKs调控白粉病抗性的分子机制。主要结果如下:1.过敏性细胞死亡与抗病代谢物质积累是中国野生葡萄叶片白粉病抗性的主要细胞学特征田间观察结果显示,四个中国野生葡萄株系表现出广谱、持久的叶片白粉病抗性;细胞学观察表明,野生葡萄株系间叶片上表皮细胞的初级结构(蜡质、角质与初生细胞壁的厚度)存在差异,但其与叶片白粉病抗性无明显相关性;白粉菌诱导下,抗病野生葡萄株系叶片产生强烈的过敏性细胞死亡并积累大量过氧化氢(H_2O_2),‘白水-40’与‘白河-35-1’叶片表皮细胞发生细胞壁沉积、抗病代谢物质积累并包裹吸器。为了明确上述生理过程是否由抗病基因介导,本研究分析了转化拟南芥抗病基因RPW8.2的‘无核白’葡萄叶片白粉病抗性。结果表明,接种白粉菌后,异位表达RPW8.2增强了转基因葡萄叶片中的水杨酸信号途径,促进表皮细胞中胼胝质积累,导致叶片发生过敏性细胞死亡与H_2O_2积累。中国野生葡萄白粉病抗性的细胞学特征与其相似,暗示中国野生葡萄可能含有类似的抗病基因。2.少毛复叶葡萄‘白水-40’含有一个CC-NB-LRR型抗白粉病基因以抗病的‘白水-40’为父本,以感病的鲜食葡萄‘莎巴珍珠’和酿酒葡萄‘佳利酿’分别为母本,构建杂交F_1代群体两个,分别获得正常成苗的F_1代单株218株和609株;在‘莎巴珍珠’ב白水-40’的F_1代群体中,抗病性主要呈现高抗和高感两种类型,抗、感病株系均为106株,经X~2检验符合1:1分离比;在‘佳利酿’ב白水-40’的F_1代群体中,抗病性呈现高抗、抗病、感病和高感四个等级,数量比为124:129:124:212,经X~2检验不符合1:1:1:1分离比。这些结果说明‘白水-40’含有一个杂合显性的抗病基因。然后,综合利用Nanopore测序与Hi-C技术,获得‘白水-40’(NAFU_BS40)与‘白河-35-1’(NAFU_BH351)染色体级别高质量基因组,其大小分别为578 Mb和548 Mb,分别注释到41251个和40225个蛋白质编码基因;其中,NLRs等抗病相关基因发生了明显的串联复制。进一步通过全基因组关联分析,将‘白水-40’抗En.NAFU1的主效抗病基因初步定位到一号染色体0.75 Mb处,该位点包含12个串联重复的CC-NB-LRR型抗病基因,根据国际葡萄抗白粉病基因命名顺序,将该位点命名为Ren12(Resistance to Erysiphe necator 12)。3.华东葡萄‘白河-35-1’的两个VpsCDPKs参与调控葡萄叶片白粉病抗性基于抗病葡萄‘白河-35-1’基因组注释信息,共鉴定到典型的VpsCDPKs 17个,成功克隆到11个。VpsCDPKs存在多种细胞器定位,其中VpsCDPK9与VpsCDPK13可同时定位于内质网、高尔基体、油体和过氧化物酶体等膜系细胞器,且N端可变结构域决定其定位模式。接种白粉菌后,VpsCDPK9、VpsCDPK13及其同源基因在‘白河-35-1’和感病葡萄‘无核白’中显著差异表达;在‘无核白’中过量表达VpsCDPK9-YFP与VpsCDPK13-YFP均能显著提高转基因葡萄的叶片白粉病抗性,同时引起叶片脱落、植株早衰等表型;出现这些抗病及生长发育表型是因为VpsCDPKs-YFP过表达促进了葡萄叶片细胞过敏性死亡,增强了抗病代谢物质与H_2O_2积累,影响了植物激素信号和内膜系统结构。此外,利用CRISPR/Cas9基因编辑技术定点突变‘无核白’葡萄的VviCDPK13,双等位突变株系的叶片白粉病抗性增强,植株易早衰,但白粉菌诱导的胼胝质积累不明显。4.VpsCDPK9与VpsCDPK13的抗白粉病功能主要依赖于水杨酸与乙烯信号途径利用mbSUS酵母双杂交系统鉴定了四个VpsCDPKs与22个候选底物蛋白的相互作用。VpsCDPK9-YFP在野生型拟南芥中过量表达后,其mRNA和蛋白质均随叶龄增加而积累,这种异常积累可引起叶片自发性细胞死亡与H_2O_2积累,导致叶片提前黄化衰老、植株矮小;表达量较低的转基因株系可以正常生长,相较于野生型,其白粉菌诱导的过敏性细胞死亡,水杨酸、乙烯与H_2O_2积累明显。但是,VpsCDPK13-YFP在野生型拟南芥中过量表达后,其蛋白质表达量低,植株无明显表型。进一步分析发现,在水杨酸(pad4sid2)或乙烯(ein2-1)突变体中过量表达后,VpsCDPK9-YFP与VpsCDPK13-YFP融合蛋白的表达量均极低,不能引起叶片早衰,也未能显著提高转基因拟南芥的白粉病抗性。说明VpsCDPK9与VpsCDPK13的抗白粉病功能主要依赖于水杨酸与乙烯信号途径。进一步以葡萄原生质体为试验系统,通过双分子荧光互补技术(Bi FC)和免疫共沉淀技术(Co-IP)确认VpsCDPK9、VpsCDPK13分别与VpsACS1、VpsACS2、VpsMAPK3和VpsMAPK6在体内互作;通过共表达试验初步证实VpsCDPK9/13可以分别磷酸化上述四个底物蛋白,并调控其蛋白质积累。此外,VpsCDPK9/13与VpsMAPK3/6协同调控VpsACS1/2的蛋白质积累,VpsMAPK3/6也可能调控VpsCDPK9/13的蛋白质积累。乙烯利和H_2O_2处理可以显著激活VpsCDPK9/13的启动子活性;田间条件下,同一种野生葡萄之间抗病株系比感病株系的叶片乙烯释放量更高,进一步表明乙烯信号途径可能参与调控中国野生葡萄叶片白粉病抗性。综上所述,本研究初步明确了中国野生葡萄叶片白粉病抗性的主要细胞学特征,揭示了中国野生葡萄白粉病抗性遗传规律,首次发现少毛复叶葡萄‘白水-40’可能含有CC-NB-LRR型主效抗白粉病基因,解析了两个VpsCDPKs的抗病机制。这些结果可以加深对葡萄抗病机理的认识,为葡萄抗白粉病精准分子育种提供理论依据。


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