紫花苜蓿响应石墨烯材料的表达谱分析及其分子机制

【摘要】：随着纳米材料在工、农、医等领域的广泛应用,其必然会通过各种途径进入环境,并进一步通过食物链在高营养水平生物中积累。许多学者发现纳米颗粒能通过增强植物氮代谢、光合作用能力,以及提高肥料养分吸收利用率等途径来达到改善作物生长,提高产量的目的。同时,当纳米粒子大量存在植物体内时,纳米材料对植物也具有毒性效应,影响植物幼苗的萌发,根系、叶片的生长以及作物的生物产量。近些年,日益严重的土地盐碱化对农场品生产和土地植被保护造成了严重的负面影响。紫花苜蓿(Medicago sativa L.)具有根系发达,抗性强的特性。作为多年生优质牧草,紫花苜蓿常种植于盐碱地。因此,其生长、发育、产量和品质容易受到盐碱胁迫的影响。为此,开展苜蓿、纳米材料及生态环境的交互作用研究具有重要意义。本研究分为两部分进行,第一,以抗性较弱的紫花苜蓿金皇后为试验材料,以适宜浓度石墨烯作为缓解盐、碱胁迫的重要物质拌在基质中培养,用转录组测序方法筛选出在改性石墨烯作用下响应盐、碱胁迫的差异基因,并对其进行GO与KEGG Pathway富集分析,以转录组学为基础,对其生物学功能、涉及到的生化代谢和信号转导等途径方面进行研究,解析石墨烯改善苜蓿耐盐碱能力的分子机理。同时,结合三代全长转录组测序技术(SMRT)提高数据质控质量,获得紫花苜蓿转录本的全长序列以及功能注释,从转录因子以及转录组结构方面入手进行深层次耐盐、碱性相关的研究,从而揭示石墨烯提高紫花苜蓿抗性的适应机制。第二,以金皇后(抗性较弱)和Bara310SC(抗性较强)为试验材料,采用沙土培养法,对比10和20 g kg~(-1)改性石墨烯胁迫下,两个品种叶片代谢物的变化,寻找胁迫环境下差异代谢物(DEMs)含量及代谢通路的变化规律。同时,以代谢组学为出发点,结合2+3代转录组测序结果,筛选出响应石墨烯胁迫的差异表达基因(DEGs),探讨它们的生物学功能、参与的生化代谢途径和信号传导途径,通过多组学联合分析揭示了紫花苜蓿对石墨烯纳米材料潜在的适应性分子机制。结论如下:(1)本研究发现适宜浓度的改性石墨烯(5 g kg~(-1))处理可以有效增加幼苗的鲜重和干重,增加叶片叶绿素含量和提高叶片与根抗氧化还原酶活性。由于渗透胁迫作用以及对细胞膜的氧化损伤,与对照组相比,在盐、碱和重度石墨烯胁迫下,紫花苜蓿叶片和根的过氧化氢(H_2O_2)、超氧阴离子(O_2·~-)和丙二醛(MDA)含量升高,叶绿素a、b含量及超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性明显低于对照组。结果还表明,在盐和碱胁迫下,5 g kg~(-1)石墨烯处理对苜蓿生长具有积极作用,例如可以加强叶片的光合作用,改善体内抗氧化系统,促进根对养分的吸收,增加产量等。(2)基于SMRT测序技术,第一部分试验共得到19.4 GB的clean reads,包括265811个CCS(circular consensus)和219162个全长非嵌合序列(FLNC),并获得12960个非冗余转录本,其中12389个转录本得到注释。RNA-seq分析显示,石墨烯处理组(C1和C2)、石墨烯-盐处理组(S1、S2和S4)和石墨烯-碱处理组(A1、A2和A4)叶片中分别鉴定了930、1114和880个DEGs,其中数百个DEGs参与激素信号传导、光合作用、呼吸和转录调控等途径。值得注意的是,5 g kg~(-1)石墨烯处理后的苜蓿叶片中与抗氧化防御系统和光合作用相关的特异性差异基因表达模式得到改善,并可迅速赋予苜蓿更高的非生物胁迫耐受性。(3)第二部分试验,我们将结合代谢组学与转录组学的数据特点,使用不同抗性紫花苜蓿品种来揭示苜蓿叶片对石墨烯胁迫的响应机制。结果表明,中度和重度石墨烯胁迫(10和20 g kg~(-1))对叶片氮代谢、抗氧化防御系统和光合作用过程有显著的干扰。对不同抗性紫花苜蓿品种叶片进行超高效液相色谱-质谱(UPLC-ESI-MS/MS)分析,共确定了406种响应石墨烯胁迫的代谢物,其中金皇后在中度和重度胁迫中分别发现62(26种上调,36种下调)和110种(49种上调,61种下调)差异代谢物,Bara310SC则分别鉴定出13(种8种上调,5种下调)和58种(30种上调,28种下调)差异代谢物。转录组数据结果显示共产生250003个FLNC,和65241个非冗余转录本。金皇后和Bara 310SC叶片在中度胁迫下分别得到7583和6163个DEGs,在重度胁迫处理下分别得到9136和9254个DEGs,且两个品种在中度和重度胁迫下共同表达1125个DEGs。代谢组学和转录组学结果表明差异表达代谢物和差异表达基因的数量与石墨烯胁迫程度呈正相关。(4)进一步分析我们发现在石墨烯胁迫(10和20 g kg~(-1))实验中,两个苜蓿品种会根据其胁迫程度改变自身氨基酸、脂质、次级代谢物(包括有机酸、异黄酮和黄酮)、核苷酸及其衍生物的含量来适应不同程度的石墨烯胁迫;转录组结果表明DEGs参与光合作用、抗氧化还原反应、氨基酸代谢以及蔗糖和淀粉代谢途径。多组学联合分析结果表明,参与氨基酸代谢通路及烟酸和烟酰胺代谢通路的差异基因和差异代谢物在石墨烯胁迫下得到显着富集,说明氨基酸代谢通路及烟酸和烟酰胺代谢途径是苜蓿适应石墨烯胁迫的关键代谢途径。